تاثیر ملانوژنیک تیروزیناز خالص قارچ بر سلول های ملانوسیت های رده B16F10: مطالعه میکروسکوپی ایمونوفلورسانس و فاز کنتراست

چکیده

رنگدانه ملانین پوست نقش مهمی در پوشش دهی، ارتباطات اجتماعی و حفاظت در برابر اثرات مضر تابش خورشید دارد. اثبات شده است که تیروزیناز نقش مهمی در تشکیل دندانه ملانوسیت ها ایفا می کند، با این حال مکانیسم مولکولی این فرایند به طور کامل شناخته نشده است. تغییرات مورفولوژیکی (ریخت شناسی) توسط میکروسکوپ فاز کنتراست مشاهده شد. این تغییرات واضح بوده و با افزایش جسم سلولی و دندانه های منشعب همراه بوده است. هدف از این مطالعه بررسی اثرات مورفوآناتومیک تیروزیناز خالص در تیرگی پوست با استفاده از ملانوسیت های رده B16F10 است که تا به امروز انجام نشده است. ملانوسیت های رده B16F10 با غلظت های مختلف تیروزیناز خالص در کنار استاندارد تیروزیناز (سیگما) به منظور تعیین مکانیسم عمل تیروزیناز خالص در تیرگی پوست تیمار شدند و سپس به روش میکروسکوپی ایمونوفلورسانس و فاز کنتراست مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. نتایج روش میکروسکوپی فاز کنتراست نشان داد که تعداد ملانوسیت ها با دندانه های ملانین دار به طور معنی داری در سلول های تیمار شده با تیروزیناز خالص در یک روش وابسته به دوز افزایش یافته که منجر به تیرگی پوست می شود. علاوه بر این، روش میکروسکوپی ایمونوفلورسانس نشان داد که تیروزیناز خالص موجب افزایش بیان سلولی تیروزیناز در یک روش وابسته به دوز شده که علت آن جذب تیروزیناز در ملانوسیت های رده B16F10 می باشد. مطالعه حاضر ثابت کرده است که تیروزیناز دارای توانایی تیرگی پوست بوده و می تواند به عنوان یک عامل ملانوژنیک ایمن در درمان اختلال کاهش رنگدانه یا ویتیلیگو (برص) عمل کند.

  1. مقدمه

توزیع منحصر بفرد رنگدانه ها در سراسر بدن موجب ایجاد رنگ ها و الگو های مختلف در تمامی موجودات زنده می شود. تولید رنگدانه تا حد زیادی ارثی بوده و تحت تاثیر ژنتیک، عوامل محیطی و عوامل درونی می باشد که میزان، نوع و توزیع ملانین را کنترل می کنند.

ملانین یک بیوپلیمر رنگی بوده که توسط سلول های خاصی به نام ملانوسیت ها تولید می شود. ملانوسیت ها خود سلول های دندانه داری هستند که بخش کوچکی از اپیدرم پوست را تشکیل می دهند. علاوه بر نقش ملانین در تعیین ویژگی های ظاهری و رنگ پوست، وظایف دیگری همچون  پردازش شنوایی و تعادل، جذب مواد شیمیایی و سمی و توسعه سیستم عصبی در جنین زایی را بر عهده دارد. ملانوسیت ها، سلول های تخصص یافته پوست با تولید ملانین در تنظیم رنگ پوست دخیل هستند. از دست دادن ملانین در اپیدرم می تواند خطر ابتلا به سرطان های پوستی و اختلالات کاهش رنگدانه را افزایش دهد. هرگونه نقصی که بر ملانوسیت ها یا عملکرد آن ها تاثیر بگذارد، می تواند منجر به افزایش، کاهش یا از دست رفتن کامل رنگدانه های پوست شود.

شایع ترین اختلال رنگدانه ای به کیفیت ملانین مرتبط نمی شود بلکه ناشی از سلول های تولید کننده رنگدانه می باشد، بطوریکه کاهش، افزایش و نبود این سلول ها مشکلاتی را به وجود می آورد. کاهش ملانین در مواردی همچون بیماری ویتیلیگو یا جهش در ژن های مربوط به رنگدانه مانند آلبینیسم و پیبالدیسم می تواند رخ دهد. افزایش تولید ملانین می تواند همراه با پاسخ های التهابی باشد همانطور که در زخم های کلوئیدی یا عملکرد غیر طبیعی ملانوسیت ها مانند خال های دیسپلازی و ملانوم بدخیم می تواند رخ دهد.

تولید ملانین در بخشی از سلول ملانوسیت به نام ملانوزوم اتفاق می افتد. مسیر بیوسنتز ملانین شناخته شده است بطوریکه دو نوع ملانین در ملانوزوم ساخته می شود: یوملانین و فئوملانین. گام اول با اکسیداسیون تیروزین به دوپاکوئینون توسط آنزیم تیروزیناز آغاز می شود. روند تولید ملانین در پستانداران بسیار پیچیده بوده و در هر مرحله کنترل می شود.

تا به امروز روش های مختلفی در درمان اختلالات کاهش رنگدانه به کمک ترکیبات سنتتیک و مصنوعی به کار رفته است اما هنوز در درمان این اختلالات موفق نبوده اند و تقاضای زیادی برای توسعه عوامل ملانوژنیک موثر تر و ایمن تر وجود دارد. اخیرا تلاش های زیادی در زمینه توسعه روش های جدید مانند استفاده از ترکیبات زیستی فعال موجود در قارچ های طبیعی در درمان اختلالات تولید رنگدانه انجام شده است. عوامل ملانوژیک جدیدی که باعث تولید ملانین می شود می توانند از گونه های بومی برخی قارچ ها تهیه شوند. عصاره گیاهان طبیعی دارای ترکیبات فیتوشیمیایی بوده که در سراسر جهان مورد استفاده قرار می گیرد و در طب سنتی هند در درمان بیماری هایی همچون سرطان، آرتریت، ناباروری، پسوریازیس و دیابت کاربرد داشتند.

از زمان های دور از عصاره گیاهانی همچون بابچی (Psoralea corylifolia) و گل سفید (Ammi majus) در درمان ویتیلیگو استفاده می شد. اخیرا گزارش شده است که گیاه بابچی و ماده موثره آن به نام پسورالن می توانند باعث پراکندگی ذرات ملانین شوند که موجب تیرگی پوست در ماهی Channa punctatus و قورباغه Bufo melanostictus گردید. نتایج چندین مطالعه نشان داد که پراکندگی ذرات ملانین توسط گیاه بابچی و ماده موثره پسورالن گیرنده های موسکارینی کولینرژیک را درگیر می کند.

در طب سنتی شرقی، قارچ ها از لحاظ درمانی دارای تاریخچه ای طولانی هستند. بسیاری از قارچ ها از جنس Auricularia، Flammulina، گانودرما، Grifola، Lentinus، دم بوقلمون و Tremella اثرات دارویی قابل توجهی از خود نشان دادند. قارچ صدفی (Pleurotus ostreatus) به طور سنتی دارای ویژگی های ضد توموری، تعدیل کننده سیستم ایمنی،کاهش کلسترول، ضد التهابی، ضد میکروبی و ضد ویروسی است. بررسی مطالعات مختلف نشان داد هیچ گونه اطلاعات قاطعی در زمینه اثرات تیروزیناز در تولید ملانین در مهره داران مختلف از جمله انسان ها وجود ندارد. علاوه بر این، هیچ مطالعه ای در زمینه استفاده از عصاره قارچ به عنوان عامل ملانوژنیک وجود ندارد، غیر از مطالعه Zehtab و همکاران که بیان کردند تیروزیناز قارچ مانع از بیماری خود ایمنی ویتیلیگو گردید. در این مطالعه، وقتی حیوانات تیروزیناز قارچ را دریافت کردند، موجب سرکوب بیماری گردید اما مکانیسم دقیق آن مشخص نشد. بنابراین در مطالعه حاضر کاملا مشخص نیست که آیا عصاره های قارچ بتوانند موجب افزایش ملانوسیت ها، دندانه ها یا ذرات ملانین شوند و تیروزیناز یا مسیر های انتقال پیام دیگری هم بتوانند موجب فعال شدن سنتز ملانین در سلول های ملانوسیت رده B16F10 شوند یا خیر.

  1. مواد و روش کار

برای مطالعه حاضر، ترکیب تیروزیناز قارچ (پودر لیوفیلیزه ≥ ۱۰۰۰ واحد/میلی گرم جامد) از شرکت Sigma-aldrich خریداری شد. آنتی بادی IgG goat anti-murine و آنتی بادی donkey anti-Goat (2 میلی گرم/میلی لیتر) از شرکت life technologies آمریکا خریداری شد. محیط کشت Dulbecco’s Modified Eagle Medium (AT006A-5L)، سرم جنین گاوی (RM10432-100ML)، آنتی بیوتیک آنتی مایکوتیک محلول (A002-20ML)، محلول تریپسین-EDTA (TCL042-5 × ۱۰۰ML)، MTT (TC191-500MG)، نمک بافر فسفات (RM7385-1PK) و تریپان آبی (RM263-5G) از شرکت HiMedia Laboratories بمبئی خریداری شدند.

۲.۱٫ تهیه تیروزیناز قارچ

تیروزیناز قارچ صدفی خاکستری (P. ostreatus) به وسیله ی رسوب دهی با آمونیوم سولفات، دیالیز و کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون و کروماتوگرافی تبادل یونی تخلیص شد.

 

۲.۲٫ آماده سازی کشت ملانوسیت

سلول های ملانوسیت رده B16F10 مورد استفاده در این مطالعه از مرکز ملی علوم سلولی شهر Pune هند خریداری شده و در محیط کشت Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) که شامل ۱۰ درصد سرم جنین گاوی غیر فعال شده توسط حرارت، ۱/۵ گرم/لیتر NaHCO3، ال-گلوتامین ۲ میلی مولار، ۱۰۰۰۰ واحد پنی سیلین، استرپتومایسین ۱۰ میکروگرم/میلی لیتر و آمفوتریسین B (25 میکروگرم/میلی لیتر) است، کشت داده شد و در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد و ۵% CO2 انکوبه گردید. به منظور جلوگیری از آلودگی میکروبی، از بنزالکونیوم کلراید ۲ درصد در انکوباتور استفاده شد. برای خالص سازی و تکثیر، سلول های رده B16F10 با تریپسین-EDTA (0/25 درصد تریپسین و ۰/۱ درصد EDTA در محلول نمکی متعادل شده هانک) از کف ظرف جدا شده و سلول ها هر سه روز به نسبت ۱ به ۳ پاساژ داده شدند. به طور کلی، بعد از ۳-۴ بار پاساژ، سلول ها از بین رفته و در صورت نیاز از سلول های نگهداری شده در نیتروژن مایع به عنوان محیط کشت تازه استفاده گردید.

۲.۳٫ بررسی زنده مانی سلول های ملانوسیت رده B16F10

روش کالریمتری MTT به منظور سنجش فعالیت میتوکندری آنزیم ها به کار می رود که با احیای MTT به فورمازون، رنگ بنفش ایجاد می شود. پس از به دست آمدن تراکم سلولی ۷۰ درصد، سلول های ملانوسیت B16F10 توسط تریپسین جداسازی شده و در پلیت های میکروتیتر ۹۶ خانه ای با تراکم ۱۰۴ سلول در هر چاهک در محیط کشت DMEM غنی شده با ۱۰ درصد چنین سرم گاوی، ۱۰۰۰۰ واحد پنی سیلین، استرپتومایسین ۱۰ میکروگرم/میلی لیتر و آنتی بیوتیک آمفوتریسین B (25 میکروگرم/میلی لیتر) کشت داده شد. بعد از یک شبانه روز انکوباسیون، محیط داخل هر چاهک جایگزین شد و سلول ها با محرک های مورد نظر جهت انجام آزمون MTT تیمار شدند تا اثرات سیتوکسیک تیروزیناز استخراج شده از قارچ P. ostreatus در کنار نمونه استاندارد تیروزیناز (سیگما) در غلظت های ۱، ۲، ۴، ۸، ۱۶، ۳۲ و ۶۴ میکروگرم/میلی لیتر در دوره های انکوباسیون ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعته بررسی شود. پس از اتمام دوره انکوباسیون، محیط کشت حاوی محرک های مورد نظر دور ریخته شده و محیط کشت تازه DMEM حاوی ۱ میلی گرم/میلی لیتر MTT به هر چاهک افزوده شده و به مدت ۴ ساعت در ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه گردید. این محلول با محلول HCl-ایزوپروپیل الکل ۰/۰۴ نرمال جایگزین شده و سپس در دمای اتاق به مدت نیم ساعت انکوبه شد. محلول نهایی در ۱۳۰۰۰ دور به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ شده و جذب محلول رویی آن در ۵۷۰ نانومتر توسط دستگاه الایزا ریدر خوانده شد.

۲.۴٫ روش میکروسکوپی فاز کنتراست

برای مشاهده مورفولوژیک زیر میکروسکوپ فاز کنتراست، سوسپانسیون سلولی با غلظت ۱۰۵ × ۱ در محیط کشت DMEM غنی شده با ۱۰ درصد جنین سرم گاوی و آنتی بیوتیک ها (۱۰۰۰۰ واحد پنی سیلین، استرپتومایسین ۱۰ میکروگرم/میلی لیتر و ۲۵ میکروگرم/میلی لیتر آنتی بیوتیک آمفوتریسین B) تهیه شد. در روز صفر، سلول های B16F10 در محیط کشت DMEM در پلیت های ۲۴ خانه ای (۱۰۵ سلول در هر چاهک) توزیع شد. پس از یک شبانه روز انکوباسیون در اتمسفر مرطوب با ۵% CO2 در ۳۷ درجه سانتیگراد، تیروزیناز خالص قارچ P. ostreatus در غلظت های نهایی ۱، ۲، ۴، ۸، ۱۶، ۳۲ و ۶۴ میکروگرم/میلی لیتر به چاهک ها اضافه شد. پلیت ها به ترتیب به مدت ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت در ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه شده و سلول ها زیر میکروسکوپ مشاهده شدند.

۲.۵٫ روش میکروسکوپی ایمونوفلورسانس

در این روش، رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس سلول های B16F10 برای شناسایی تیروزیناز طبق روش Cheung و همکاران انجام شد. ایمونوفلورسانس روشی است که به کمک میکروسکوپ فلورسانس انجام می شود. در این روش از ویژگی آنتی بادی ها در مقابل آنتی ژن ها استفاده می شود تا رنگ فلورسنت را در بیومولکول های درون سلول توزیع کنند. پس از مشاهده توزیع مولکول ها در نمونه، پروتئین ها، مولکول های زیستی کوچک و مولکول های غیر زیستی می توانند مورد بررسی قرار گیرند. سلول ها بر روکش شیشه ای قرار گرفته در هر چاهک در یک پلیت ۲۴ خانه ای (۱۰۴× ۲ سلول در هر چاهک) به مدت ۲۴ ساعت رشد می کنند. پس از یک شبانه روز انکوباسیون، تیروزیناز خالص قارچ P. ostreatus در کنار نمونه استاندارد تیروزیناز (سیگما) در غلظت های ۱، ۲، ۴، ۸، ۱۶، ۳۲ و ۶۴ میکروگرم/میلی لیتر به مدت ۴۸ ساعته افزوده شد. بعد از انکوباسیون، سلول ها با محلول PBS شست و شو داده شده و با محلول پارافرمالدهید ۳% به مدت ۲۰ دقیقه در دمای اتاق فیکس و توسط تریتون X-100 در PBS نفوذ پذیر شدند. سلول ها با ۱۰۰ میکرولیتر آنتی بادی IgG تیروزیناز goat anti-murine به مدت ۱۵ دقیقه انکوبه شدند. بعد از سه بار شست و شو سلول ها با محلول PBS به مدت ۱۰ دقیقه، سلول ها یک ساعت در دمای اتاق با آنتی بادی دوم یا donkey anti-Goat انکوبه شدند. سلول ها با محلول PBS شست و شو داده شدند و با ۱ میکروگرم/میلی لیتر محلول رنگی DAPI به مدت ۱۰ دقیقه در دمای اتاق تیمار شدند تا هسته سلول ها رنگ گرفته و سپس زیر میکروسکوپ فلورسانس مشاهده شدند.

  1. نتایج

۳.۱. بررسی زنده مانی سلول های ملانوسیت رده B16F10

روش MTT بر روی سلول های B16F10 انجام شد تا تاثیر تیمار تیروزیناز خالص قارچ P. ostreatus بر زنده مانی سلول ها در محدوده غلظتی ۱ تا ۶۴ میکروگرم/میلی لیتر بررسی شود. نتایج نشان داد که با افزایش غلظت تیروزیناز خالص قارچ، درصد زنده مانی سلول ها کاهش یافته است، بطوریکه در محدوده غلظتی ۱ تا ۶۴ میکروگرم/میلی لیتر بین ۹۸% تا ۹۲% بوده است. بیشترین درصد زنده مانی سلول ها در غلظت ۲ میکروگرم/میلی لیتر به دست آمد که برابر با ۹۸% بوده است (۰/۵±۰/۳۷۶ میلی گرم/ ۱۰۵×۱ سلول) (p > 0.005). حداکثر تکثیر نمونه استاندارد تیروزیناز (سیگما) برابر با ۹۹/۷۳ درصد (۰/۵± ۰/۳۸۱ میلی گرم/ ۱۰۵×۱ سلول)  (p < 0.005) برآورد شده است که ۱۰۰% در نظر گرفته می شود (۰/۵± ۰/۳۸۲ میلی گرم/ ۱۰۵×۱ سلول). در حالیکه طول دوره تیمار از ۴۸ ساعت تا ۷۲ ساعت افزایش یافت، در دوز بالای ۸ میکروگرم/میلی لیتر هیچ افزایشی در تکثیر سلولی مشاهده نشد و پس از رسیدن تراکم سلولی به ۵۸/۱۱ درصد (۰/۵± ۰/۲۲۲ میلی گرم/ ۱۰۵×۱ سلول) ) (p < 0.005) در بالای این دوز، با کاهش تدریجی رشد در مقایسه با نمونه کنترل (۰/۵± ۰/۳۸۲ میلی گرم/ ۱۰۵×۱ سلول) رو به رو شدیم (شکل ۱).

شکل ۱٫ تاثیر تیروزیناز خالص قارچ P. ostreatus (64-1 میکروگرم/میلی لیتر) بر زنده مانی سلول های ملانوسیت رده B16F10 طی ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت. نتایج بر اساس میانگین ± انحراف معیار و در سه بار تکرار انجام شد. p < 0.005 نشان دهنده معنی دار بودن داده ها است.

۳.۲. مشاهده سلول های ملانوسیت رده B16F10 با میکروسکوپ فاز کنتراست

تشکیل و توسعه دندانه یکی از مشخصه های ظاهری ملانوسیت رده B16F10 در پوست می باشد زیرا وظیفه انتقال ملانوزوم ها به کراتینوسیت های مجاور را بر عهده دارند. مشاهده میکروسکوپی فاز کنتراست به منظور بررسی اثرات تیروزیناز خالص قارچ بر ویژگی های ظاهری و تکثیر ملانوسیت های رده B16F10 نشان داد که میزان تکثیر سلولی و تشکیل دندانه در یک روش وابسته به دوز (۶۴-۱ میکروگرم/میلی لیتر) طی زمان ۲۴ و ۴۸ ساعت افزایش یافت. نمونه استاندارد تیروزیناز موجب افزایش تکثیر سلولی در غلظت ۸ میکروگرم/میلی لیتر گردید. افزایش تعداد دندانه در ملانوسیت های تیمار شده به راحتی قابل مشاهده بود.

تغییرات ظاهری ملانوسیت های B16F10 حاصل از تاثیر تیروزیناز خالص قارچ P. ostreatus بسیار واضح بوده، بطوریکه با افزایش جسم سلولی و دندانه های منشعب در مقایسه با نمونه های تیمار نشده همراه بوده است. اکثر سلول های تیمار نشده دارای ۲-۱ دندانه با سیتوپلاسم مشخص هستند (شکل a2). حداقل غلظت تیروزیناز خالص (۴-۱ میکروگرم/میلی لیتر) هم موجب تغییرات ظاهری در ملانوسیت ها شده است بطوریکه موجب توسعه کمتر دندانه ها با سیتوپلاسم مشخص شده است (شکل b2 و c2). با افزایش غلظت تیروزیناز قارچ (۱۶-۸ میکروگرم/میلی لیتر)، افزایش بیشتری در تعداد دندانه ها مشاهده شد بطوریکه باعث تشکیل تک لایه ای متراکم در محیط کشت طی ۲۴ تا ۴۸ ساعت گردید (شکل d2 و e2). در بالاترین غلظت تیروزیناز خالص (۳۲ و ۶۴ میکروگرم/میلی لیتر) شبکه منشعب چند قطبی از دندانه ها تشکیل شد و گرانول های رنگی متراکم در سیتوپلاسم سلول های B16F10 تیمار شده مشاهده شد (شکل f2).

شکل ۲٫ تغییرات ظاهری سلول های ملانوسیت رده B16F10. ملانوسیت با ۲-۱ دندانه و سیتوپلاسم مشخص (a)، توسعه کمتر دندانه ها با سیتوپلاسم مشخص (b، c)، دندانه های بیشتر با تشکیل تک لایه متراکم (d، e)، شبکه منشعب چند قطبی از دندانه ها (f). تمامی تصاویر توسط میکروسکوپ فاز کنتراست با بزرگنمایی ۲۰۰X گرفته شده است.

۳٫۳. مشاهده سلول های ملانوسیت رده B16F10 با میکروسکوپ ایمونوفلورسانس

اولین گام در افزایش فعالیت تیروزیناز، افزایش تولید آنزیم در سطح پروتئینی است. بنابراین مطالعه حاضر جهت ارزیابی اثرات تیروزیناز خالص قارچ P. ostreatus بر جذب پروتئین تیروزیناز در ملانوسیت های B16F10 انجام شده است. در بررسی میکروسکوپی ایمونوفلورسانس زمانی که سلول ها با تیروزیناز خالص قارچ در غلظت های مشخص شده (۶۴-۱ میکروگرم/میلی لیتر) به مدت ۴۸ ساعت تیمار شدند، بیان بیشتر پروتئین تیروزیناز در ملانوسیت ها مشاهده شد که به صورت نور فلورسنت نارنجی-قرمز نمایان گردید. در حالیکه بیان تیروزیناز در سلول های تیمار نشده بسیار ناچیز بوده است (شکل a3). سلول های ملانوسیت B16F10، سطح تیروزیناز بالاتری را در منطقه اطراف هسته نشان دادند.

در غلظت های پایین تیروزیناز قارچ (۸-۱ میکروگرم/میلی لیتر)، افزایش بیان پروتئین تیروزیناز در یک روش وابسته به دوز مشاهده شده است و تغییر در ملانوسیت های B16F10 مشخص است (شکل b3-d3). حداکثر بیان پروتئین تیروزیناز در غلظت های ۱۶ تا ۶۴ میکروگرم/میلی لیتر مشاهده شده است که شدت نور فلورسنت نارنجی-قرمز بیشتر شده است (شکل e3-g3) و نمونه استاندارد تیروزیناز هم بیشترین میزان بیان را در غلظت ۸ میکروگرم/میلی لیتر داشته است (شکل h3). سلول های ملانوسیت B16F10 کاهش اندکی در شدت نور فلورسنت نشان دادند که به دلیل کاهش تیروزیناز سلولی طی انکوباسیون به مدت ۷۲ ساعت با تیروزیناز قارچ در غلظت های مشخص (۶۴-۱ میکروگرم/میلی لیتر) شده بوده است.

شکل ۳٫ بررسی ایمونوفلورسانس ملانوسیت های B16F10. بیان ناچیز تیروزیناز در سلول های تیمار نشده (a)، در غلظت های پایین تیروزیناز قارچ (۸-۱ میکروگرم/میلی لیتر)، افزایش بیان پروتئین تیروزیناز در یک روش وابسته به دوز مشاهده شده است (b-d)، . حداکثر بیان پروتئین تیروزیناز در غلظت های ۱۶ تا ۶۴ میکروگرم/میلی لیتر مشاهده شده است (e-g)، نمونه استاندارد تیروزیناز هم بیشترین میزان بیان را در غلظت ۸ میکروگرم/میلی لیتر داشته است (h). تمامی تصاویر توسط میکروسکوپ فاز کنتراست با بزرگنمایی ۲۰۰X گرفته شده است.
  1. بحث

طی چندین دهه گذشته، به علت نقش کلیدی تیروزیناز در فرایند ملانوژنز، به یکی از بزرگترین نگرانی ها تبدیل شده است. ملانوژنز فرایندی است که منجر به تشکیل رنگدانه های تیره ملانین می شود. ملانین در نتیجه واکنش های شیمیایی و آنزیمی تولید می شود. آنزیم استخراج شده از قارچ خوراکی Agaricus bisporus بسیار مشابه نمونه آن در پستانداران است که می تواند در مطالعات مربوط به تولید ملانین به کار رود. درواقع، به منظور انجام مطالعات در زمینه مهار تیروزیناز، از تیروزیناز قارچ استفاده شده است زیرا این آنزیم به صورت تجاری در دسترس است.

یافته های مطالعه حاضر بر روی تیروزیناز قارچ P. ostreatus نشان داد که با افزایش غلظت تیروزیناز قارچ از ۶۴-۱ میکروگرم/میلی لیتر، کاهش زنده مانی سلول ها از ۹۸% تا ۹۲% مشاهده شده است. حداکثر درصد زنده مانی در غلظت ۲ میکروگرم/میلی لیتر بوده است که برابر با ۹۸% براورد شده است. حداکثر تکثیر نمونه استاندارد تیروزیناز (سیگما) برابر با ۹۹/۷۳ درصد برآورد شده است که ۱۰۰% در نظر گرفته شد. در حالیکه طول دوره تیمار از ۴۸ ساعت تا ۷۲ ساعت افزایش یافت، در دوز بالای ۸ میکروگرم/میلی لیتر هیچ افزایشی در تکثیر سلولی مشاهده نشد و پس از رسیدن تراکم سلولی به ۵۸/۱۱ درصد در بالای این دوز، با کاهش تدریجی رشد در مقایسه با نمونه کنترل رو به رو شدیم. نتایج این مطالعه با یافته های Mallick و همکاران مطابقت دارد که نتایج مشابهی از اثرات چربی کل جنینی (PTLF) بر زنده مانی سلول های ملانوسیت B16F10 به دست آوردند. مشاهده شد که در حضور مقادیر بالای [۳H]-تیمیدین، PTLF موجب پاسخ های تکثیری متفاوتی از سلول های B16F10 شده است. پاسخ میتوژنیک در غلظت ۱ میلی گرم/میلی لیتر از PTLF شروع شده (۱۰۱ × ۶%) و به حداکثر میزان خود (۱۵۲%) در غلظت ۱۰ میلی گرم/میلی لیتر در مقایسه با نمونه کنترل (۱۰۰%) رسید. در غلظت های بالاتر از ۱۰ میلی گرم/میلی لیتر، رشد رو به کاهش بوده و تقریبا ۹۵% رشد نمونه کنترل در غلظت ۲۰۰ میلی گرم/میلی لیتر مشاهده شده است. کاهش رشد ناشی از مرگ سلولی نبوده زیرا هیچ سلولی از بین نرفته است. مطالعه دیگری که Lee و همکاران در سال ۲۰۰۵ انجام دادند، گزارش کردند که درصد زنده مانی سلول های ملانومای B16 در حضور غلظت های ۰/۲، ۰/۵ و ۱ میلی مولار گلیسیریزین افزایش یافته است اما در غلظت ۱/۵ میلی مولار به طور معنی داری کاهش یافت. یافته های حاضر با مطالعه Yoon و همکاران که اثرات ایزوپاندوراتین A و ۴-هیدروکسی پاندوراتین A بر درصد زنده مانی سلول های ملان A را بررسی کردند، مطابقت کامل دارد. سلول های ملان A با غلظت های مختلف (۱۰۰-۱ میلی مولار) این ترکیبات به مدت ۷۲ ساعت تیمار شدند اما هیچ تاثیر معنی داری بر زنده مانی سلول و ویژگی های ظاهری ملانوما B16F10 مشاهده نشد.

نتایج مطالعه حاضر با مطالعه Jeon و همکاران در زمینه بررسی اثرات ترکیبات اصلی اسانس گل نیلوفر آبی برملانوسیت های انسان مطابقت دارد. در این مطالعه، ملانوسیت ها با ۱۰ میکروگرم/میلی لیتر اسانس گل نیلوفر به مدت ۵ روز تحریک شدند. درصد زنده مانی سلول ها به طور معنی داری در غلظت ۱۲/۵ میکرومولار افزایش یافته و در غلظت ۲۵ و ۵۰ میکرومولار کاهش یافته است. ضمنا، مطالعه حاضر با مطالعه Moreira و همکاران تطابق دارد که اثرات عصاره گیاه P. venusta بر زنده مانی سلول ها بررسی کردند و مشاهده شد که ترکیب حامل عصاره این گیاه موجب کاهش معنی داری در درصد زنده مانی سلول (۱۲/۴ درصد) شده است درحالیکه عصاره ها هیچ اثرات سیتوکسیکی بر سلول ها نداشتند.

در مطالعه Moleephan و همکاران در زمینه اثرات سیتوکسیک گزانتوکسیلین بر سلول های ملانوما B16F10 مشاهده شد که با افزایش غلظت، درصد زنده مانی سلول ها کاهش یافت. یافته های حاضر همچنین ثابت کرده است که تیروزیناز خالص قارچ P. ostreatus موجب تحریک تولید ملانین می شود بدون این که موجب بروز اثرات سیتوکسیک شود. این نتیجه با مطالعه Yamauchi و همکاران مطابقت دارد که سنتز گلیکوزید کوئرستین و فعالیت ملانوژنز آن ها در سلول های ملانوما B16 را بررسی کردند.

طی چند دهه گذشته، مکانیسم مولکولی تشکیل دندانه ملانوسیت ها توجه زیادی را به خود جلب کرده است. در این مطالعه، اثرات تیروزیناز خالص قارچ P. ostreatus بر ویژگی های ظاهری سلول های ملانوسیت رده B16F10 مورد بررسی قرار گرفته است. تغییرات ایجاد شده در ملانوسیت های B16F10 تیمار شده با غلظت های ۶۴-۱ میکروگرم/میلی لیتر تیروزیناز با افزایش جسم سلولی و تعداد دندانه ها در مقایسه با نمونه های تیمار نشده همراه بوده است بطوریکه تعداد دندانه ها در نمونه های تیمار نشده ۱-۲ عدد بوده است. حداقل غلظت تیروزیناز خالص (۴-۱ میکروگرم/میلی لیتر) موجب تغییرات ظاهری در ملانوسیت ها شده است بطوریکه موجب توسعه کمتر دندانه ها با سیتوپلاسم مشخص شده است. با افزایش غلظت تیروزیناز قارچ (۱۶-۸ میکروگرم/میلی لیتر)، افزایش بیشتری در تعداد دندانه ها مشاهده شد بطوریکه باعث تشکیل تک لایه ای متراکم در محیط کشت طی ۲۴ تا ۴۸ ساعت گردید. در بالاترین غلظت تیروزیناز خالص (۳۲ و ۶۴ میکروگرم/میلی لیتر) شبکه منشعب چند قطبی از دندانه ها تشکیل شد و گرانول های رنگی متراکم در سیتوپلاسم سلول های B16F10 تیمار شده مشاهده شد.

یافته های مطالعه حاضر نشان داد که تیروزیناز خالص قارچ با تشکیل دندانه و تجمع رنگدانه ها همراه بوده است که با نتایج مطالعه Lin و همکاران مطابقت دارد. در این مطالعه عصاره فلفل سیاه و ماده موثره پپرین موجب تغییرات ظاهری در سلول های ملان شده که با افزایش تعداد دندانه همراه بوده است. Mallick و همکاران بیان کردند که پس از۲-۳ روز تیمار سلول ها با PTLF، سلول های ملانوما B16F10 با افزایش تشکیل دندانه ها، رشد کرده و ایجاد تک لایه ای متراکم کردند. تشکیل شبکه منشعب چند قطبی از دندانه ها و گرانول های رنگی متراکم در سیتوپلاسم این سلول ها هم مشاهده شد. Takeyama و همکاران نشان دادند که کوئرستین موجب تحریک دندانه ها و گسترش آن ها به سمت کراتینوسیت های مجاور در محیط کشت پوست انسانی شده است. نتایج مطالعه حاضر با داده های Moleephan و همکاران همخوانی دارد که گزارش کردند گزانتوکسیلین موجب تحریک تشکیل دندانه های ملانوسیتی B16F10 شده که در انتقال ملانوزوم ها به کراتینوسیت های مجاور طی فرایند تولید ملانین نقش دارد.

در این آزمایشات، اندازه گیری کیفی میزان بیان تیروزیناز به روش رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس انجام شد. اولین گام در افزایش فعالیت تیروزیناز، افزایش تولید آنزیم در سطح پروتئینی است. بنابراین مطالعه حاضر جهت ارزیابی اثرات تیروزیناز خالص قارچ P. ostreatus بر جذب پروتئین تیروزیناز در ملانوسیت های B16F10 انجام شده است. یافته ها نشان داد زمانی که سلول ها با تیروزیناز خالص قارچ در غلظت های مشخص شده (۶۴-۱ میکروگرم/میلی لیتر) به مدت ۴۸ ساعت تیمار شدند، بیان بیشتر پروتئین تیروزیناز در ملانوسیت ها مشاهده شد که به صورت نور فلورسنت نارنجی-قرمز نمایان گردید. در حالیکه بیان تیروزیناز در سلول های تیمار نشده بسیار ناچیز بوده است، سلول های ملانوسیت B16F10 سطح تیروزیناز بالاتری را در منطقه اطراف هسته نشان دادند. همچنین مشاهده شد که طی انکوباسیون با تیروزیناز قارچ به مدت طولانی (۷۲ ساعت)، سلول های ملانوسیت B16F10 کاهش اندکی در شدت نور فلورسنت در تمامی غلظت ها (۶۴-۱ میکروگرم/میلی لیتر) نشان دادند که به دلیل کاهش تیروزیناز سلولی بوده است.

مطالعه حاضر بیان بیشتر تیروزیناز با سیتوپلاسم مشخص را در سلول های ملانوسیتی B16F10 تیمار شده با تیروزیناز قارچ نشان داده است که با نتایج Mallick و همکاران در زمینه تاثیر PTLF بر بیان پروتئین تیروزیناز با استفاده از مطالعات ایمونوفلورسانس مطابقت دارد. در این مطالعه بیان شد که در سلول های B16F10 تیمار شده با ۱۰ میکروگرم/میلی لیتر PP و۵۰ میکروگرم/میلی لیتر PPPF به مدت ۴۸ ساعت، بیان بیشتر پروتئین تیروزیناز در مقایسه با نمونه های تیمار نشده مشاهده شد.

Park و همکاران اثرات هارمالین و هارمالول را بر بیان تیروزیناز بررسی کردند. دریافتند که هارمالین و هارمالول موجب تحریک سنتز ملانین و فعالیت تیروزیناز شده و همچنین باعث افزایش بیان تیروزیناز، TRP-1 و TRP-2 می شود. از طرفی دیگر، حضور عواملی که موجب افزایش سطح cAMP داخل سلولی شود مانند dbcAMP، ایزوبوتیل متیل گزانتین (IBMX)، عصاره های هیدروالکلی گیاه P. venusta و عصاره Kaliziri می تواند منجر به افزایش بیان تیروزیناز در ملانوسیت های B16F10 شود.

در این مطالعه، با یک رویکرد میکروسکوپی مشخص شد که تیروزیناز قارچ صدفی خاکستری (P. ostreatus) دارای مزایای بیولوژیکی مختلف بدون هیچ اثرات سیتوکسیک می باشد. این تیروزیناز عامل مهمی در تیرگی پوست و محافظت در برابر نور می باشد. یافته های مطالعه حاضر نشان داد که تیروزیناز نقش کلیدی در تولید ملانین بر عهده دارد و می تواند به عنوان یک عامل ملانوژنیک قوی در درمان ویتیلیگو به شمار رود.

منبع: ncbi

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *