تاثیر قارچ شیتاکه بر بهبود پوکی استخوان

مطالعه آزمایشگاهی اثرات القایی عصاره آبی Lentinula edodes (shiitake) بر کشت سلول های استئوبلاست انسانی

چکیده: اثرات عصاره آبی قارچ Lentinula edodes (LE) بر روی دو کشت سلولی (HOS 58  و Saos-2) بررسی شد تا ویژگی های استخوان سازی این قارچ خوراکی تعیین گردد. فعالیت آلکالین فسفاتاز و معدنی شدن به عنوان شاخص های زنده مانی و بلوغ سلول های استخوانی مورد استفاده قرار گرفتند. کشت سلول های استئوسارکوما HOS 58 به مدت ۵ روز طی رقت سازی پیاپی عصاره آبی L. edodes (0.8-125 μg/mL) سبب افزایش قابل توجه فعالیت آلکالین فسفاتاز (ALP) سلول ها در مقایسه با سلول های تیمار نشده شد. سلول های Saos-2 که با LE (20 μg/mL) و β-گلیسرول فسفات (۲ mM) طی ۲۱ روز انکوبه شدند، افزایش دو برابری معدنی شدن را نسبت به سلول های کشت شده با کنترل مثبت β-گلیسروفسفات به تنهایی نشان دادند. نتایج بدست آمده به وضوح فعالیت LE را به عنوان یک عامل القایی در تشکیل استخوان در شرایط آزمایشگاهی نشان می دهد. بنابراین قارچ L. edodes می تواند به عنوان یک روش درمانی حمایتی و تغذیه ای در بیماری های مرتبط با اختلالات استخوانی از جمله پوکی استخوان، استئوپنی و عوارض دیرهنگام دیابت تلقی شود.

مقدمه

پوکی استخوان پس از یائسگی یکی از مشکلات سلامتی مرتبط با سن در زنان محسوب می شود. علت آن ممکن است تعادل منفی کلسیم ناشی از کمبود رژیم غذایی یا کاهش جذب کلسیم روده و همچنین افزایش دفع کلسیم ادراری مرتبط با کمبود استروژن طی یائسگی باشد. درمان جایگزینی با هورمون (HRT) یک روش تثبیت شده در پیشگیری از کاهش تراکم استخوان پس از یائسگی محسوب می شود. شواهد اخیر نشان می دهد که استفاده طولانی مدت آن با عوارض جانبی همچون افزایش خطر ابتلا به سرطان های سینه، تخمدان و مخاط رحم همراه است. بنابراین، استفاده از رژیم غذایی مکمل با اثربخشی و ایمنی کافی می تواند در پیشگیری و درمان پوکی استخوان پس از یائسگی مفید باشد.

طب سنتی چین (TCM) از هزاران سال پیش بطور گسترده ای در درمان شکستگی ها و بیماری های مفاصل استفاده می شود. در طب سنتی چین گیاهان بسیاری وجود دارند که در جلوگیری و درمان پوکی استخوان کاربرد دارند. اگر چه این داروهای گیاهی به وسیله مصرف کنندگان سنتی آن ها به عنوان گزینه های ارزان قیمت مورد استفاده قرار می گیرند، پذیرش بین المللی آنها به عنوان یک گزینه مهم در پیشگیری و/یا درمان پوکی استخوان مستلزم تحقیقات گسترده با استفاده از روش های معتبر علمی است.

قارچ ها شامل طیف وسیعی از ویتامین ها از جمله نیاسین، تیامین، ریبوفلاوین، بیوتین و ویتامین C هستند. علاوه براین، قارچ ها حاوی انواع مولکول های فعال زیستی مانند ترپنوئید ها، استروئید ها، فنول ها، نوکلئوتید ها، گلیکوپروتئین ها و پلی ساکارید ها هستند. در طب سنتی ادعا می شود برخی قارچ ها دارای ویژگی های ضد توموری، ضد ویروسی، آنتی بیوتیکی، ضد التهابی، کاهش قند خون، کاهش کلسترول خون، کاهش فشار خون و سایر ارزش های تغذیه ای و درمانی هستند. یکی از مهمترین آن ها  Grifola frondosa می باشد، که در طب سنتی چین و ژاپن (Kampo) کاربرد گسترده ای دارد. اثبات شده است که دارای فعالیت های ضد دیابتی، ضد توموری و ضد پوکی استخوان می باشد. طی تحقیقات غربالگری ما به منظور کشف فعالیت های زیستی و ترکیبات جدید قارچ های دارویی، مشخص شد قارچ L. edodes هم دارای اثرات تحریک کنندگی بر سلول های استخوانی می باشد.

Shiitake نام رایج ژاپنی قارچ Lentinula edodes بوده، که به عنوان دومین قارچ خوراکی دنیا از لحاظ تولید محسوب می شود. این قارچ به طور طبیعی بر چوب های افتاده جنگل های پهن برگ رشد می کند. Wu Juei پزشک چینی سلسله مینگ (۱۶۴۴-۱۳۶۸)، بطور گسترده ای درباره این قارچ نوشت و به توانایی آن در افزایش انرژی، بهبود سرماخوردگی، از بین بردن کرم روده، حفظ و ارتقاء سلامتی و بهبود گردش خون و متابولیسم اشاره کرد. امروزه،  L. edodes در طب سنتی به عنوان تعدیل کننده سیستم ایمنی کاربرد دارد که موجب بهبود کیفیت زندگی و جلوگیری از بیماری های متابولیک می شود. لنتینان یک β-گلوکان جدا شده از قارچ بوده که ثابت شده می تواند به عنوان یک داروی کمکی در درمان تومور استفاده شود.

Lentinula edodes دارای یک ترکیب با خاصیت کاهش کلسترول می باشد که در ابتدا تحت عناوین لنتیسین (lentysine) یا لنتیناسین (lentinacin) نام داشتند اما بعدا با عنوان اریتادنین شناخته شد. مشاهده شد که  L. edodes میزان کلسترول سرم خون را در موش های صحرایی کاهش داد. علاوه بر این، نشان داده شد که فیبر شوینده خنثی (NDF) جدا شده از L. edodes دارای اثرات کاهشی بر کلسترول متفاوت از تاثیر اریتادنین بوده است. استاتین ها عوامل طبیعی و مصنوعی کاهش دهنده کلسترول هستند که هم در شرایط آزمایشگاهی و هم در مدل انسانی سبب تحریک تشکیل استخوان شدند. با توجه به ارتباط بین داروهای کاهش دهنده کلسترول و پوکی استخوان، فرض می شود ترکیبات غذا-دارویی که موجب کاهش کلسترول می شوند، بتوانند اثرات محافظتی در برابر پوکی استخوان داشته باشند. هدف از مطالعه حاضر تعیین ویژگی عصاره Lentinula edodes در تحریک تشکیل استخوان در شرایط آزمایشگاهی می باشد. قبلا، تنها یک مطالعه در زمینه اثر پرتودهی L. edodes با اشعه UV به همراه افزایش ویتامین D2 و کلسیم به منظور جلوگیری از پوکی استخوان در موش انجام گرفته است.

بحث و نتیجه گیری

با توجه به اثرات Lentinula edodes در کاهش کلسترول و ارتباط احتمالی بین غلظت کلسترول پلاسما و پوکی استخوان بواسطه سنتز کلسترول و فعالسازی سلول های استئوکلاست، ما فرض کردیم این قارچ بتواند در تعدیل سلول های استخوان مفید باشد. بنابراین، ما تاثیر عصاره آبی این قارچ را بر رده سلول های سرطانی استئوکلاست HOS 58 و Saos-2 بررسی کردیم. تجزیه و تحلیل دقیق ترکیبات شیمیایی L. edodes صورت نگرفت، اما عصاره آبی آن بطور کلی مورد ارزیابی قرار گرفت. در ابتدا، ما با استفاده از انگشت نگاری HPLC با جداسازی RP18، به تعیین پروفایل شیمیایی آن پرداختیم (شکل ۱). اکثر ترکیبات به صورت ضعیف بر روی ستون باقی ماندند و به سرعت شسته شدند (پس از ۹ دقیقه زمان ماندگاری، هیچ پیک آشکاری مشاهده نشد). علاوه بر این، جذب UV نسبتا ضعیف بوده و اکثر ترکیبات در ۲۰۶ نانومتر شناسایی شدند که نشان دهنده حضور کم پیوند های دوگانه کونژوکه می باشد. این مشاهده برای عصاره محلول در آب صورت گرفته و نشان دهنده حضور ترکیبات کربوهیدراتی است و توسط TLC تایید شده است (داده ها نشان داده نشده است).

با توجه به اثرات Lentinula edodes در کاهش کلسترول و ارتباط احتمالی بین غلظت کلسترول پلاسما و پوکی استخوان بواسطه سنتز کلسترول و فعالسازی سلول های استئوکلاست، ما فرض کردیم این قارچ بتواند در تعدیل سلول های استخوان مفید باشد. بنابراین، ما تاثیر عصاره آبی این قارچ را بر رده سلول های سرطانی استئوکلاست HOS 58 و Saos-2 بررسی کردیم. تجزیه و تحلیل دقیق ترکیبات شیمیایی L. edodes صورت نگرفت، اما عصاره آبی آن بطور کلی مورد ارزیابی قرار گرفت. در ابتدا، ما با استفاده از انگشت نگاری HPLC با جداسازی RP18، به تعیین پروفایل شیمیایی آن پرداختیم (شکل ۱). اکثر ترکیبات به صورت ضعیف بر روی ستون باقی ماندند و به سرعت شسته شدند (پس از ۹ دقیقه زمان ماندگاری، هیچ پیک آشکاری مشاهده نشد). علاوه بر این، جذب UV نسبتا ضعیف بوده و اکثر ترکیبات در ۲۰۶ نانومتر شناسایی شدند که نشان دهنده حضور کم پیوند های دوگانه کونژوکه می باشد. این مشاهده برای عصاره محلول در آب صورت گرفته و نشان دهنده حضور ترکیبات کربوهیدراتی است و توسط TLC تایید شده است (داده ها نشان داده نشده است).

شکل ۱٫ ساختار های انگشت نگاری HPLC عصاره L. edodes (μg30 بر ستون)، RP18 آب/اسید فرمیک-متانول. سیاه: ۲۰۶ نانومتر، قرمز: ۲۵۴ نانومتر، تصویر کوچکتر نشان دهنده بزرگنمایی در ۲۵۴ نانومتر است.

فرایند تشکیل استخوان را می توان به سه مرحله تقسیم کرد: تکثیر، بلوغ ماتریس و معدنی شدن. این فرایند پیچیده در شرایط آزمایشگاهی تنها با استفاده از رده های سلولی صورت می گیرد. با این حال، جهت افزایش اعتبار نتایج ما و جلوگیری از هر گونه داده های مثبت کاذب، ما از دو رده سلولی مختلف استفاده کردیم. سلول های Saos-2 به طور گسترده ای به عنوان یک مدل استخوانی در محیط آزمایشگاهی استفاده می شوند. این رده سلولی دارای ویژگی های متعددی در مدل انسانی از جمله تولید سیتوکین و معدنی شدن ماتریس بوده که مشخصه اصلی فرایند استئوبلاست (استخوان سازی) می باشد. علاوه بر این، به نظر می رسد سلول هایHOS 58 به دلیل بیان آلکالین فسفاتاز حساس خود، برای غربالگری در شرایط آزمایشگاهی مناسب باشند. ما از رشد سلولی به عنوان شاخص مرحله تکثیر و از فعالیت آلکالین فسفاتاز به عنوان شاخص بلوغ ماتریس و معدنی شدن ماتریس خارج سلولی (ECM) استفاده کردیم.

زنده مانی سلول. تست های رنگ سنجی مبتنی بر تترازولیوم یکی از رایج ترین روش ها برای شناسایی بقا و تکثیر سلول های پستانداران هستند. MTT یک تترازولیوم زرد رنگ محلول در آب بوده که توسط سلول های زنده به ترکیب ارغوانی رنگ نا محلول فورمازان احیا می شود. میزان فورمازان تولید شده متناسب با تعداد سلول های زنده است.

آزمون سمیت LE هیچونه سمیت سلولی را بواسطه کاهش زنده مانی سلول ها نشان نداده است (شکل ۲). حتی در بالاترین غلظت های مورد آزمایش (μg/mL120)، سلول های HOS 58 فعالیت متابولیکی خود را حفظ کردند. ما هیچ گونه افزایشی در تعداد سلول ها یا بقای آن ها در هیچ یک از غلظت های مورد آزمایش مشاهده نکردیم، که نشان می دهد LE هیچ اثرات میتوتیکی ندارد.

شکل ۲٫ تاثیر غلظت های مختلف عصاره آبی Lentinula edodes بر تکثیر سلول های استئوسارکوما HOS 58 با استفاده از روش MTT مورد ارزیابی قرار گرفت. هیچ اختلاف معنی داری در محدوده غلظتی مورد آزمایش مشاهده نشد. هر ستون نشان دهنده میانگین ± انحراف معیار (تعداد:۲۴) است و در سه بار تکرار انجام گرفته است.

تاثیر بر محتوای پروتئین کل سلولی. شکل ۳ نشان می دهد که عصاره LE تا غلظت μg/mL30 هیچ تاثیری بر تولید پروتئین توسط سلول های HOS 58 نداشته است. بالاتر از این غلظت، تولید پروتئین کاهش یافته است، بطوریکه به ۸۵% کنترل رسیده است. به علت عدم سمیت، این موضوع می تواند به عنوان تحریک بلوغ سلولی در نظر گرفته شود. این امر منجر به کاهش تولید ECM و در نتیجه کاهش تولید پروتئین سلولی شود. ما هیچ گونه افزایش پروتئین سلولی در هیچ غلظتی مشاهده نکردیم. این نتایج از فرضیه ما مبنی بر اینکه LE به ترتیب سبب افزایش بلوغ سلولی، کاهش تکثیر سلولی و تولید ماتریس خارج سلولی می شود، حمایت می کند.

شکل ۳٫ تاثیر غلظت های مختلف عصاره آبی Lentinula edodes بر محتوای پروتئینی کل سلول های HOS 58. محتوای پروتئینی با رسم منحنی استاندارد به کمک BSA ارزیابی شد. هر ستون نشان دهنده میانگین ± انحراف معیار (تعداد:۲۴) است و در سه بار تکرار انجام گرفته است.

تاثیر بر فعالیت آلکالین فسفاتاز. فعالیت آلکالین فسفاتاز به عنوان شاخص بلوغ سلول های استئوبلاست شناخته می شود.  این آنزیم نشانه ای از مرحله میانی تشکیل استخوان به حساب می آید و در مرحله بلوغ ماتریس بیشتر خود را نشان می دهد. اخیرا، این آنزیم نقش مبهم اما حیاتی در معدنی سازی ماتریس ایفا می کند.

شکل ۴ به وضوح افزایش معنی دار (p < 0.01) فعالیت آلکالین فسفاتاز را در سلول های استئوسارکوما HOS 58 انسانی در غلظت های μg/ML3/25 تا μg/mL30 از LE  نشان می دهد. غلظت های بالاتر LE، افزایش بیشتر فعالیت آلکالین فسفاتاز را نشان می دهند، اما بنظر می رسد بالاتر از سطح مجاز پلاسما باشد (داده ها نشان داده نشده است). این نتایج از فرضیه ما مبنی بر اینکه LE سبب تسریع بلوغ سلول های استئوبلاست در شرایط آزمایشگاهی می شود، حمایت می کند، در حالیکه پروتئین سلولی تحت تاثیر قرار نگرفته است، فعالیت آلکالین فسفاتاز (و سپس معدنی سازی ECM) افزایش یافته است. DMSO هیچ افزایشی در فعالیت آلکالین فسفاتاز در مقایسه با نمونه کنترل از خود نشان نداده است. ترکیب β-گلیسروفسفات (mM2)، به عنوان کنترل مثبت استفاده گردید و موجب افزایش معنی دار فعالیت آلکالین فسفاتاز با رفتار سلولی نرمال در محدوده معمول شده است.

شکل ۴٫ تاثیر غلظت های مختلف عصاره آبی Lentinula edodes بر فعالیت آلکالین فسفاتاز سلول های HOS 58. افزایش معنی داری در فعالیت این آنزیم در محدوده μg/mL 30-3 مشاهده شده است. هر ستون نشان دهنده میانگین ± انحراف معیار (تعداد:۲۴) است و در سه بار تکرار انجام گرفته است. اختلاف p < 0.05 از لحاظ آماری معنی دار تلقی می شوند (p ≤ 0.01**، *p ≤ 0.05).

تاثیر بر معدنی شدن سلول های استخوان. جهت انجام آزمون LE، ما تاثیر معدنی شدن را با استفاده از سلول های Saos-2 در شرایط آزمایشگاهی بررسی کردیم. این روش حساس به طور کامل درک نشده است و نیازمند ECM پیچیده، یک ALP فعال (در مراحل اولیه) و غلظت مشخصی از فسفر غیر آلی می باشد. معدنی شدن به عنوان آخرین مرحله تشکیل استخوان به طور آشکاری ماهیت استخوان را نشان می دهد.

پس از ۲۱ روز کشت، سلول های Saos-2 در غیاب β-گلیسروفسفات (bGP) رشد کرده و هیچ معدنی سازی مشاهده نشد (شکل A5). افزودن mM2 از bGP برای فعالسازی فرایند معدنی سازی ضروری بوده و سبب رسوب کلسیم قابل تشخیص از ۱۰% ناحیه رشد کل شد (شکل B5 و ۶).این مشاهدات توسط محققان دیگر هم نشان داده شده است و اغلب غلظت های بالاتر از mM10 از bGP به منظور معدنی سازی استفاده گردید.

شکل ۵٫ تشکیل ندول معدنی شده توسط سلول های Saos-2 پس از رنگ آمیزی با Von Kossa بعد از سه هفته کشت مشاهده می شود. بدون bGP (A) سلول ها به طور طبیعی رشد کرده اما معدنی شدن مشاهده نمی شود. در شکل B سلول های کشت داده شده با bGP، ندول های معدنی شده را هم نشان می دهند. هنگامی که با μg/mL20 عصاره آبی Lentinula edodes همراه می شود (C)، منطقه معدنی شده تا دو برابر نسبت به bGP به تنهایی افزایش می یابد.

با این حال، غلظت های بالای mM4 از bGP توسط سلول های مورد آزمایش ما قابل تحمل نبوده است (داده ها نشان داده شده است). زمانی که سلول های Saos-2 با μg/mL20 عصاره آبی LE و mM2 از bGP ترکیب شد، اندازه و تعداد ندول های معدنی شده افزایش یافت. در این مورد، ناحیه ندول های معدنی شده به طور آشکاری از ۱۰% به ۲۲% افزایش یافت (شکل های C5 و ۶). این نتایج با افزایش فعالیت ALP سلول های HOS 58 مطابقت دارد و بشدت مفهوم استئوژنیک قارچ LE را تایید می کند. ارتباط مثبت بین فعالیت ALP و تشکیل استخوان توسط سایر محققان هم اثبات شده است و پیشنهاد شده است که فعالیت ALP بیشتر نشان دهنده افزایش تشکیل استخوان است که همسو با نتایج ما می باشد.

شکل ۶٫ تاثیر عصاره آبی Lentinula edodes (μg/mL20) بر معدنی شدن در شرایط آزمایشگاهی. ندول های معدنی شده توسط نرم افزار CellExplorer 2001 اندازه گیری شدند. هر ستون نشان دهنده میانگین ± انحراف معیار (تعداد:۱۰) است و در دو بار تکرار انجام گرفته است. اختلاف p < 0.05 از لحاظ آماری معنی دار تلقی می شوند (*p ≤ 0.05).

بخش تجربی

مواد شیمیایی و بیوشیمیایی. لوازم پلاستیکی کشت سلولی، سرم جنین گاوی (FBS)، بافر فسفات (PBS)، ال-گلوتامین، تریپسین و آنتی بیوتیک ها از Biochrom KG خریداری شدند (برلین، آلمان). آلبومین سرم گاوی، محیط کشت IMDM در حضور یا عدم حضور فنل رد از شرکت Invitrogen خریداری شدند (کارلسروهه، آلمان). سایر معرف ها از شرکت سیگما تهیه شدند (دیسن هافن، آلمان). سلول های HOS 58  به عنوان هدیه از پروفسور A. Battmann تهیه شد (دانشگاه گیسن، آلمان). سلول های  Saos-2 از شرکت DSZM خریداری شد (برانشوایگ، آلمان).

تهیه عصاره Lentinula edodes. پودر خشک شده حاصل از اندام زایشی Lentinula edodes از GAMU GmbH Krefeld تهیه گردید. پودر مورد نظر پس از ۲۴ ساعت ترکیب با آب دیونیزه توسط دستگاه سوکسله عصاره گیری شد. عصاره به واسطه لیوفیلیزاسیون (بازده : ۱۱/۵ درصد) خشک شد و در ۴ درجه سانتی گراد نگهداری شد. قبل از استفاده، عصاره در DMSO (mg/mL10) حل شده و توسط فیلتراسیون استریلیزه می شود.

انگشت نگاری HPLC. عصاره L. edodes در آب (mg/mL10) حل شده و μL10 به ستون تزریق شد (Merck Lichrospere, 5 μm, RP18). تجزیه و تحلیل بر روی Shimadzu LC2010AHT انجام شد (کیوتو، ژاپن). فاز متحرک آب-۰/۱ درصد اسید فرمیک (A) و متانول (Fisher Scientific, gradient grade) -0/1 درصد اسید فرمیک (B) طی ۱۵ دقیقه با سرعت جریان mL/min 0/8 به کار گرفته شد. سیگنال ها با استفاده از آشکارساز UV در طول موج های ۲۰۶ نانومتر و ۲۵۴ نانومتر شناسایی شدند.

کشت سلولی. سلول های استئوسارکوما انسانی HOS 58 و Saos-2 به صورت تک لایه در محیط کشت IMDM با ۱۰% سرم جنین گاوی، mM2 ال-گلوتامین و ۱% محلول پنی سیلین-استرپتومایسین (پنی سیلین۱۰۰۰۰ IE/mL، استرپتومایسین ۱۰۰۰۰ μg/mL) رشد کردند. هر دو رده سلولی در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد، رطوبت ۹۵%، ۵% CO2 کشت مجدد شدند.

به منظور انجام آزمایش، سلول های HOS 58 به مدت ۴۸ ساعت در پلیت های ۹۶ خانه ای ریخته شدند. پس از دو بار شست و شو با PBS، محیط کشت به IMDM بدون فنل رد و حاوی ۰/۰۵ درصد آلبومین سرم گاوی، mM2 ال-گلوتامین و ۱% آنتی بیوتیک ها تغییر کرد. غلظت های مختلف عصاره LE در محیط کشت با استفاده از محلول استوک (mg/mL10 در DMSO) و رقت های پیاپی تهیه شد. غلظت نهایی DMSO از ۰/۰۵ درصد تجاوز نکرد. سایر روش ها در زیر آورده شده است.

بررسی بقا و تکثیر سلول ها (روش MTT). روش MTT به منظور ارزیابی میزان بقا و تکثیر سلولی استفاده می شود. سلول های HOS 58 با غلظت های مختلف LE (8.0 μg/mL-125μg/mL) به مدت ۴۳ ساعت انکوبه شدند. پس از شست و شو، ۲۰ میکرولیتر MTT در IMDM (mg/mL5، سیگما، آلمان) به هر چاهک افزوده شد. پلیت ها در ۳۷ درجه سانتیگراد، رطوبت ۹۵% و CO2 5% به مدت ۵ ساعت انکوبه شدند. در پایان، محلول MTT حذف شده و کریستال ها در ۲۰۰ میکرولیتر DMSO حل شدند. پس از حل شدن کامل، پلیت ها به مدت ۵ دقیقه انکوبه شده و جذب در طول موج ۵۹۰ نانومتر اندازه گیری شد. بقای سلول ها بواسطه درصد نمونه کنترل محاسبه گردید.

بررسی بلوغ سلول ها. بررسی بلوغ سلول ها به منظور تعیین ویژگی تشکیل استخوان توسط سلول های استئوبلاست صورت می گیرد. سلول های HOS 58 با غلظت های مختلف LE به مدت ۵ روز انکوبه شدند. در روز سوم، محیط کشت تغییر داده شد. سلول ها سپس لیز شده و فعالیت آنزیم ALP در محلول رویی تعیین شد.

لیز شدن سلول ها. سلول های تیمار شده با عصاره LE یا نمونه حامل با PBS شسته شده و با افزودن ۱۰۰ میکرولیتر Triton X-100 (0/1 درصد) در Tris-HCl 0/1 مولار (۹/۸=pH) لیز شده و سپس از روش انجماد/ذوب و مخلوط کردن شدید استفاده گردید. سوسپانسیون تهیه شده سانتریفیوژ شده و محلول رویی (لیز شده سلولی) از نظر محتوای پروتئینی و فعالیت ALP مورد ارزیابی قرار گرفت.

اندازه گیری محتوای پروتئینی. محتوای پروتئین کل سلولی به روش اصلاح شده Bradford به کمک معرف Roti-Nanoquant (کارلسروهه، آلمان) با توجه به دستورالعمل سازنده اندازه گیری شد. به طور خلاصه، ۱۰ میکرولیتر از محلول لیز شده سلولی با PBS (1:4) در یک صفحه میکروتیتر رقیق شد. معرف Roti-Nanoquant (200 میکرولیتر) افزوده شد و میزان جذب در طول موج ۴۰۵ نانومتر و ۶۲۰ نانومتر ثبت شد. محتوای پروتئین کل با رسم منحنی استاندارد به کمک آلبومین سرم گاوی (BSA) محاسبه شد.

فعالیت آلکالین فسفاتاز. فعالیت سلولی این آنزیم بواسطه آزاد شدن ۴-نیتروفنل (۴-NP) از ۴-نیتروفنیل فسفات (۴-NPP) تعیین می شود. میزان مساوی از محلول لیز شده سلولی با  بافر آمینوپروپانول (AMP) 0/2 مولار (۹/۸=pH) و mM24 (4-NPP) در (AMP) مخلوط شد. پس از انکوباسیون (۳۷ درجه سانتیگراد)، واکنش توسط ۵۰ میکرولیتر NaOH 0/5 مولار متوقف شد و جذب در طول موج ۴۰۵ نانومتر قرائت شد. غلظت ۴-NP با رسم منحنی کالیبراسیون تعیین شد.

معدنی شدن. سلول های Saos-2 در پلیت های ۲۴ خانه ای (۱۰۴ سلول/خانه) با استفاده از محیط کشت، کاشته شدند و تا تلاقی ۹۰% رشد کردند. محیط کشت حذف شده و سلول ها در محیط آزمایش در حضور یا عدم حضور عصاره LE (μg/mL20) به مدت ۲۱ روز نگهداری شدند. محیط کشت هر دو روز تغییر داده شد. در نهایت، معدنی شدن با افزودن mM2 β-گلیسروفسفات (bGP) صورت گرفت. در پایان دوره انکوباسیون، سلول ها به منظور رسوب املاح معدنی به واسطه روش Von Kossa رنگ آمیزی شدند. پس از شست و شو با PBS گرم، سلول ها با ۵% گلوتار آلدهید در آب دیونیزه به مدت ۳۰ دقیقه فیکس شدند. لایه های سلولی دو بار با آب دیونیزه شسته شده و با ۵% نیترات نقره در آب تحت اشعه UV به مدت ۵۰ دقیقه انکوبه شدند. سپس سلول ها سه بار با آب دیونیزه شسته شده و ۵% سدیم تیوسولفات در آب به مدت دو دقیقه اضافه گردید. پس از آخرین مرحله شست و شو، سلول ها از نظر وجود نقاط رنگی (سیاه) زیر میکروسکوپ مورد بررسی قرار گرفتند و به کمک دوربین دیجیتال مدل Canon EOS 20 D عکس گرفته شد. تغییرات در تعداد ندول های معدنی شده و ناحیه آن ها با استفاده از نرم افزار CellExplorer 2001 ارزیابی شد.

آنالیز آماری. به منظور ارزیابی فعالیت ALP، سه آزمون مستقل با ۸ تکرار صورت گرفت و داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شدند. اختلاف آماری با استفاده از آزمون یک طرفه ANOVA مورد ارزیابی قرار گرفت، بطوریکه p ≤ ۰٫۰۵ به عنوان اختلاف معنی دار توصیف می شود. در مورد روش معدنی شدن، هر ستون نشان دهنده میانگین ± انحراف معیار ده عکس از دو آزمون مستقل است.

نتیجه گیری

در این مطالعه، برای اولین بار از عصاره آبی قارچ Lentinula edodes به منظور تحریک معدنی سازی و فعالیت آلکالین فسفاتاز کشت سلول های استئوبلاست انسانی استفاده شد. با توجه به غلظت های دارویی به کار رفته (˂ ۳۰ μg/mL)، نتایج ما نشان داد این عصاره سبب افزایش فعالیت تشکیل استخوان در سلول های استخوانی گردید.

این تاثیر مثبت بر سلول های استخوانی با مقادیر کم عصاره نشان از وجود ترکیبات فعال بالقوه ای در این قارچ می دهد که سبب تحریک تشکیل استخوان و معدنی شدن آن می شود. این ترکیبات در آینده باید شناسایی شوند. میزان کلسیم در L. edodes زیاد بالا نیست، بنابراین تاثیر کلسیم در کسب این نتایج بعید نیست.

در نتیجه، نشان داده شد عصاره آبی L. edodes دارای اثرات تقویتی بر استخوان بوده و نقش احتمالی در پیشگیری از پوکی استخوان دارد. بنابراین، عصاره LE می تواند در به تاخیر انداختن عوارض دیر هنگام دیابت به خصوص اختلالات استخوانی ناشی از دیابت کمک کند. به منظور تایید نتایج مطرح شده، آزمایشات بالینی تصادفی شده دوسوکور بر روی انسان و حیوان باید صورت گیرد.

منبع: ncbi

پاسخی بگذارید

Your email address will not be published.

top