فعالیت ضد التهابی گانودرما لوسیدوم در درمان لوپوس اریتروماتوز سیستماتیک

فعالیت ضد التهابی مکمل های گانودرما لوسیدوم و San‑Miao‑San در موش های MRL/ lpr در درمان لوپوس اریتروماتوز سیستماتیک

چکیده

تاریخچه: گانودرما لوسیدوم (Lingzhi یا LZ) و San-Miao-San  (SMS) دارو های چینی هستند که به ترتیب در درمان بیماری های التهابی و سندروم آرترالژی (Bi Zheng) استفاده می شوند. از آنجایی که علائم اصلی بیماری لوپوس اریتروماتوز سیستمیک (SLE) شامل التهاب و درد مفاصل، ادم و تپش قلب مرتبط با Bi Zheng می باشد، تصور می شود LZ و SMS بتوانند در درمان این بیماری خودایمنی موثر باشند. هدف این مطالعه، بررسی فعالیت ضد التهابی فرمول ترکیبی LZ و SMS (LZ–SMS) در موش های مبتلا به لوپوس می باشد.

روش کار: از موش های ماده بالغ ۲۴-۲۰ هفته ای نژاد Balb/c به عنوان موش های سالم (تعداد: ۱۰) استفاده شد، در حالیکه موش های ماده ۲۴-۱۲ هفته ای MRL/ lpr به سه گروه (تعداد : ۱۰ در هر گروه) شامل موش های مبتلا به بیماری SLE با شدت خفیف، متوسط و شدید تقسیم شدند. مشخصات بالینی موش های Balb/c و بیمار (از جمله وزن بدن، ضخامت مفاصل، میزان فعال بودن بیماری، پروتئینوری، لکوسیتوری و لنفادنوپاتی) مورد بررسی قرار گرفتند. غلظت پلاسمایی آنتی بادی های ضد هسته ای (ANA) و آنتی بادی ضد DNA دو رشته ای به روش الایزا مورد بررسی قرار گرفت، در حالیکه غلظت برخی سیتوکین های کلیدی (IFN-γ، TNF-α، IL-6، IL-10، IL-2، IL-27، IL-12P70، IL-17A و IL-21) به روش لومینکس چندگانه بررسی شد. پروفایل بیان ژن برای تمایز لنفوسیت های Th در سلول های طحال CD4+ Th به روش RT-qPCR بررسی شد. از روش فلوسایتومتری به منظور اندازه گیری درصد سلول های T تنظیمی +CD4+CD25+Foxp3 و سلول های B تنظیمی +CD19+CD5+CD1d+IL-10 استفاده شد.

نتایج: غلظت آنتی بادی های ضد DNA دو رشته ای در پلاسما در موش های تیمار شده با LZ–SMS (500 میلی گرم/کیلوگرم/روز به صورت خوراکی به مدت ۷ روز و سپس ۵۰ میلی گرم/کیلوگرم/روز به صورت تزریق داخل صفاقی به مدت ۷ روز) در موش های با شدت بیماری متوسط و شدید بطور قابل توجهی در مقایسه با نمونه های تیمار شده با PBS کاهش یافت (P < 0.05).

پس از تیمار با LZ–SMS، سطح بیان سلول های T تنظیمی (iTreg) و T طبیعی (nTreg) بطور قابل توجهی بالاتر از Th17، Th1 و سایر سلول های Th متداول بود (P < 0.05). درصد سلول های +CD4+CD25+Foxp3 جمع آوری شده از طحال، تیموس و سلول های خون محیطی و همچنین درصد سلول +IL-10 جمع آوری شده از طحال و تیموس در موش های SLE تیمار شده با LZ–SMS بطور قابل توجهی در مقایسه با گروه تیمار نشده PBS افزایش یافت. پس از تیمار موش های بیمار با شدت متوسط و شدید، نسبت درصد سلول های +CD4+CD25+Foxp3 به درصد سلول های T موثر CD4+CD25 بطور قابل توجهی در مقایسه با گروه تیمار نشده PBS افزایش یافت (P < 0.05). علاوه بر این، در مقایسه با گروه تیمار شده با PBS، کاهش قابل توجهی در غلظت برخی سیتوکین های التهابی از جمله IL-21، IL-10 و IL-17A (P < 0.05همچنین افزایش قابل توجه IL-2 و IL-12P70 در موش های تیمار شده با LZ–SMS (P < 0.05) مشاهده شد.

نتیجه گیری: درمان با LZ–SMS افزایش قابل توجهی در درصد سلول های +CD4+CD25+Foxp3 و +IL-10 و کاهش غلظت پلاسمایی برخی سیتوکین های التهابی و کاهش بیان سیتوکین های مرتبط با ژن ها در موش های مبتلا به SLE را به همراه داشت. ویژگی های بالینی موش های تیمار شده با LZ–SMS بطور قابل توجهی بهبود یافت.

مقدمه

لوپوس اریتروماتوز سیستمیک (SLE)، یک بیماری خود ایمنی مزمن با شیوع بالا در زنان میانسال است که اغلب در نتیجه آسیب به اندام هایی از جمله کلیه، پوست، قلب، عروق خونی و سیستم عصبی مرکزی ایجاد می شود. اگرچه داروهای مختلفی برای این بیماری وجود دارد که به بهبود قابل توجه بیماری و کاهش آسیب به اندام ها کمک می کند اما این دارو ها گران بوده و عوارض جانبی ناخواسته ای ایجاد می کنند.

گانودرما لوسیدوم (Lingzhi یا LZ) دارای اثرات آنتی اکسیدانی، ضد التهابی و ضد درد می باشد و توانایی بالقوه ای در درمان طیف گسترده ای از بیماری ها از جمله هپاتیت، فشار بالا، آرتریت و برونشیت دارد. گانودرما لوسیدوم موجب گسترش سلول های CD4+ T به سلول های T تنظیم کننده +Foxp3 هم در موش و هم انسان شده است که می تواند در بهبود بیماری کولیت حاد موثر باشد. بیان شده است که LZ موجب تعدیل فعالیت سلول های تک هسته ای محیطی می شود و تولید سیتوکین های پاتوژن مرتبط با SLE مانند TNF-α، IL-1β، IL-12 و IL-6 را سرکوب می کند.

San-Miao-San (SMS) یک داروی چینی بوده که ترکیبی از سه گیاه Rhizoma atractylodis (CangzhuCortex phellodendri (Huangbai) و Radix achyranthis bidentatae (Niuxi) به نسبت ۱:۱:۱ (وزنی:وزنی:وزنی) می باشد. این ترکیب در درمان سندروم آرترالژی (Bi Zheng) استفاده می شود که یک سندروم انسدادی دردناک ناشی از حمله عوامل بیماری زای خارجی به ماهیچه ها، تاندون ها، استخوان ها و مفاصل است. Bi Zheng هم مانند SLE می تواند سبب درد مفاصل، ادم و تپش قلب ناشی از اثرات مضر آن شود. بنابراین تصور می شود ترکیب LZ و SMS بتواند در درمان این بیماری خودایمنی موثر باشد. گیاه شناسان استفاده ترکیبی از LZ و SMS (LZ–SMS) را به علت فعالیت ضد التهابی آن ها به عنوان یک روش درمانی پیشنهاد دادند. علاوه بر این، نتایج چندین مطالعه بالینی نشان داده است که فرمول ترکیبی استاندارد LZ و SMS کاملا ایمن بوده و با بیماران مبتلا به آرتریت روماتوئید (RA) سازگار بوده است. با این حال، مکانیسم ضد التهابی LZ و SMS در درمان بیماری SLE هنوز مورد بررسی قرار نگرفته است.

ما قبلا مکانیسم های انتقال پیام داخل سلولی که وظیفه تنظیم فعالسازی ائوزینوفیل ها، سلول های اپیتلیال و سینوویوسیت های شبه فیبروبلاست (FLS) در انسان را بر عهده دارند، طی التهاب بررسی کردیم و نقش پاتولوژیک سیتوکین ها در بیماری های آلرژیک و خودایمنی را مورد مطالعه قرار دادیم. هدف این مطالعه، بررسی فعالیت ضد التهابی LZ–SMS در موش های مبتلا به لوپوس می باشد.

مواد و روش کار

مواد

عصاره آب داغ ترکیب LZ–SMS مورد استفاده در این مطالعه شامل یک پودر لیوفلیزه بوده که مطابق روش ارائه شده توسط موسسه طب چینی دانشگاه هنگ کنگ آماده سازی شد. این عصاره از ترکیب ۳۵/۷ درصد LZ و SMS بوده که SMS خود از ترکیب سه گیاه چینی با نسبت ۲۱/۴ درصد Cangzhu، ۲۱/۴ Huangbai و ۲۱/۴ درصد Niuxi بوده است. ترکیب آماده شده در سالین فیزیولوژیک حل شده و سپس به روش LAL (Limulus amoebocyte lysate) بررسی شده تا مشخص شود هیچ لیپوپلی ساکارید قابل تشخیصی وجود ندارد. ترکیب شیمیایی گیاهان مختلف به روش کروماتوگرافی لایه نازک مورد بررسی قرار گرفته و بر اساس چندین منابع مختلف فارماکوپه چینی ۲۰۱۰ تایید شد.

موش ها

موش های ماده MRL/lpr از آزمایشگاه Jackson خریداری شده و در یک محیط عاری از پاتوژن در مرکز LASC دانشگاه هنگ کنگ نگهداری شدند. از موش های ماده بالغ ۲۴-۲۰ هفته ای نژاد Balb/c به عنوان موش های سالم (تعداد: ۱۰) استفاده شد و موش های ماده ۲۴-۱۲ هفته ای MRL/ lpr (تعداد : ۳۰) در مرکز مراقبت از حیوانات، نگهداری شدند. تمامی آزمایشات انجام شده بر حیوانات زنده با کنترل دقیق و بر اساس راهنمای کمیته اخلاق کار با حیوانات آزمایشگاهی انجام شده و مورد تایید کمیته CUHK قرار گرفته است.

بررسی فعالیت بیماری

نمونه های ادرار جمع آوری شده از گروه های مختلف موش ها (تعداد: ۱۰) به کمک نوار های تست ادرار URS-5T از لحاظ پروتئین و لکوسیت مورد بررسی قرار گرفت. موش های ماده ۲۴-۱۲ هفته ای MRL/ lpr بر اساس سیستم امتیاز دهی پروتئینوری به سه گروه (تعداد : ۱۰ عدد در هر گروه) شامل موش های مبتلا به بیماری SLE با شدت خفیف، متوسط و شدید تقسیم شدند، بطوریکه امتیاز ۰: mg/dL 15-0، امتیاز ۱: ۲۹-۱۶ mg/dL، امتیاز ۲: ۹۹-۳۰ mg/dL، امتیاز ۳: ۲۹۹-۱۰۰ mg/dL، امتیاز ۴: ۱۹۹۹-۳۰۰ mg/dL و امتیاز ۵: بیشتر از ۲۰۰۰ mg/dL را شامل می شود (امتیاز ۱-۰ : شدت خفیف بیماری، امتیاز ۳-۲: شدت متوسط بیماری و امتیاز ۵-۴: فرم شدید بیماری).

شاخص های بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی

اثرات نفریتیک ترکیب LZ–SMS بر موش های نژاد Balb/c و MRL/lpr (هر گروه : ۵) طی تزریق روزانه خوراکی و داخل صفاقی به مدت ۱۴ روز مورد بررسی قرار گرفت. تجویز خوراکی به مقدار ۵۰۰ میلی گرم/کیلوگرم/روز در ۴۰۰ میکرولیتر PBS از روز ۷-۱ بوده است (تعداد : ۵ عدد برای موش های مبتلا به لوپوس در گروه SLE و موش های Balb/c در گروه سالم). دوز ۵۰ میلی گرم/کیلوگرم/روز ترکیب LZ–SMS در ۴۰۰ میکرولیتر PBS به دلیل حلالیت پایین آن تهیه شد. این دوز به صورت داخل صفاقی از روز ۱۴-۸ به موش های مبتلا به لوپوس یا سالم (۵ مورد در هر گروه) تزریق شد. به منظور تزریق داخل صفاقی این دوز پایین، ابتدا ترکیب را فیلتر کرده تا هرگونه مواد نامحلول حذف شود و سپس ۱/۲۵ میلی گرم از این محلول شفاف LZ–SMS روزانه به هر موش تزریق شد. میزان ۴۰۰ میکرولیتر PBS روزانه به مدت ۱۴ روز مطابق روش مورد استفاده در گروه کنترل PBS (تعداد: ۵ عدد در هر گروه) به هر موش داده شد. به منظور بررسی هرگونه سمیت گیاهی احتمالی، وزن بدن موش ها قبل و بعد از تجویز LZ–SMS اندازه گیری شد.

موش ها ۱ روز بعد از تجویز LZ–SMS، از لحاظ چندین پارامتر ایمونولوژیکی ازجمله غلظت پلاسمایی آنتی بادی های ضد هسته ای (ANA)، آنتی بادی ضد DNA دو رشته ای و برخی سیتوکین ها (IFN-γ، TNF-α، IL-6، IL-10، IL-2، IL-27، IL-12P70، IL-17A و IL-21) در کل خون مورد بررسی قرار گرفتند. شدت و حدت بیماری در هر گروه (تعداد: ۱۰) قبل و بعد از درمان مطابق مقیاس سنجش ۴ امتیازی مورد ارزیابی قرار گرفت: ۳-۰؛ امتیاز ۰ طبیعی بوده، امتیاز ۱ به فرم خفیف بیماری اشاره دارد (نواحی مانند دهان و گوش ها را درگیر می کند)، امتیاز ۲ فرم متوسط بیماری بوده (کمتر از ۲ سانتی متر از نواحی دهان، گوش ها و بخش داخلی کتف را تحت تاثیر قرار می دهد) و امتیاز ۳ نشان دهنده فرم شدید بیماری است (بیشتر از ۲ سانتی متر از نواحی دهان، گوش ها و بخش داخلی کتف را تحت تاثیر قرار می دهد).

ارزیابی هیستوپاتولوژیکی

برش های طولی کلیه از طریق پاپیلا انجام شد، در بافر پارافرمالدهید ۴% فیکس شده و سپس در پارافین تثبیت شد. برش های کلیه متعاقبا به قطعات ۲ میکرومتری تقسیم شده و با پریودیک اسید شیف (PAS) رنگ آمیزی شدند. تعداد سلول های مزانژیال در گلومرول ها با شمارش هسته آن ها تعیین شد. آزمایش میکروسکوپی به منظور ارزیابی ناحیه گلومرول ها با حضور ۱۰۰ گلومرول در هر گروه انجام شد. میزان نفوذپذیری رگ، نفریت بینابینی و گلومرولوفریت مطابق سیستم نمره دهی ماکروسکوپی زیر امتیازدهی شدند: ۰=عادی، ۲-۱= خفیف، ۳= متوسط و ۵-۴= شدید.

ارزیابی RTqPCR

آنالیز ترانسکریپتوم برای تمایز سلول های Th به کمک روش RT2 profiler PCR array انجام شد. استخراج RNA از سلول های CD4+ Th طحال با استفاده از کیت RNeasy Mini صورت گرفت. سلول های CD4+ Th طحال به کمک کیت جداسازی سلول Th موش با خلوص سلولی بیشتر از ۹۵% خالص سازی شد. RNA خالص از ۱۰۶×۱ سلول CD4+ Th طحال مطابق دستورالعمل سازنده کیت RT2 profiler PCR array آنالیز شد. بیان mRNA به روش زیر محاسبه گردید:

Expt به معنی آزمایش، ctrl کنترل، GOI ژن مورد نظر و HKG ژن خانگی نام دارند.

آنالیز فلوسایتومتری سلول های T تنظیمی +CD4+CD25+Foxp3، سلول های T موثر  CD4+CD25 و سلول های B تنظیمی +CD19+CD5+CD1d+IL-10

سلول های محیطی، طحال و تیموس (۱۰۶×۱ در هر مورد) از موش های نژاد Balb/c و MRL/ lpr رنگ آمیزی شده تا تعداد سلول های T تنظیمی +CD4+CD25+Foxp3، سلول های T موثر  CD4+CD25 و سلول های B تنظیمی +CD19+CD5+CD1d+IL-10 به روش فلوسایتومتری تعیین شود.

غلظت پلاسمایی ANA و آنتی بادی ضد DNA دو رشته ای

غلظت پلاسمایی ANA و آنتی بادی ضد DNA دو رشته ای در هر گروه با استفاده از کیت های تجاری ELISA ارزیابی شد.

غلظت سیتوکین های پلاسما در موش های Balb/c و MRL/ lpr

قبل ار بررسی غلظت سیتوکین ها، پلاسما در دمای ۸۰- درجه سانتیگراد نگهداری شده و سپس غلظت برخی از آن ها از جمله IFN-γ، TNF-α، IL-6، IL-10، IL-2، IL-27، IL-12P70، IL-17A و IL-21 به کمک کیت های Milliplex MAP اندازه گیری شد.

آنالیز آماری

نتایج آنالیز آماری آرایه ژن ها در بخش آنالیز داده ها و هیبریداسیون آرایه ژن ها بیان شده است. این نتایج به صورت میانگین ± انحراف معیار با توزیع نرمال توصیف شده است. داده های غیر پارامتری هم بر اساس مقادیر میانه آن ها بیان شد. آزمون Mann–Whitney U برای متغیر های پیوسته مورد استفاده قرار گرفت. مقایسه گروه های مختلف به کمک آزمون Kruskal–Wallis انجام شد و سپس از Dunn’s test برای مقایسه تفاوت ها و محاسبه ارزش P در هر جفت داده ها استفاده شد. از آنالیز واریانس دوطرفه به منظور مقایسه گروه ها و تیمار های مختلف استفاده شد و سپس آزمون Bonferroni با هدف مقایسه میانگین تکرار ها و محاسبه ارزش P در هر جفت داده ها بکار گرفته شد. تمامی فرضیه ها دوطرفه بودند و ارزش P کمتر از ۰/۰۵ معنی دار در نظر گرفته شد. تمامی این داده ها به کمک نرم افزار GraphPad Prism ورژن ۶ مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

نتایج

مشخصه های بیماری SLE در موش های MRL/lpr

علائم بالینی موش های مختلف به صورت خلاصه در جدول ۱ بیان شده است. موش های MRL/lpr که با PBS تیمار شده بودند، بر اساس فعالیت بیماری به سه زیر گروه (شدت خفیف، متوسط و شدید) تقسیم شدند که انعکاسی از امتیازدهی پروتئینوری آن ها بوده است. درصد لنفادنوپاتی و وزن بدن درگروه های مختلف موش های MRL/lpr به طور معنی داری بالاتر از موش های کنترل بود (P = 0.034). علاوه بر این هیچگونه عوارض جانبی در موش های MRL/lpr مورد مطالعه مشاهده نشد که معنی دار نبودن کاهش وزن بدن موش های تیمار شده توسط LZ–SMS را تایید می کند (P > 0.05). در تمامی موش های MRL/lpr با شدت متوسط (P < 0.001) و شدید بیماری (P = 0.035)، میزان امتیاز پروتئینوری و لکوسیتوری بالاتر از گروه کنترل بود. با این حال، تفاوت معنی داری در این امتیازدهی بین گروه های با شدت خفیف بیماری و گروه کنترل مشاهده نشد (P = 0.056). میزان امتیاز ضخامت مفاصل و میزان فعال بودن لوپوس در موش های MRL/lpr با شدت متوسط (P = 0.036) و شدید بیماری (P = 0.030) بطور قابل توجهی بالاتر از گروه کنترل بود.

تضعیف نفریت در موش های MRL/lpr تحت درمان با LZ SMS

به منظور تایید نقش درمانی  LZ–SMS، ما علائم بالینی نفریت را در موش های MRL/lpr پس از درمان با LZ–SMS یا PBS بررسی کردیم. همانطور که در شکل ۱ مشخص شده است، نمرات پروتئینوری، لکوسیتوری، میزان فعال بودن لوپوس، گلومرولونفریت، نفریت بینابینی و نفوذ پذیری رگ ها در موش های MRL/lpr قبل از درمان با LZ–SMS بطور معنی داری بالاتر از گروه کنترل Balb/c بوده است (P < 0.05). نتایج درمان با LZ–SMS، بهبودی آشکاری را در وضعیت نفریت در مقایسه با درمان با PBS به تنهایی نشان داد (شکل ۱ و ۲). علاوه بر این، تفاوت معنی داری در غلظت پلاسمایی ANA و آنتی بادی ضد DNA دو رشته ای در موش های SLE با فرم متوسط و شدید در مقایسه با گروه کنترل Balb/c تحت درمان با PBS مشاهده شد (P < 0.01)(شکل ۳). اگرچه غلظت پلاسمایی ANA و آنتی بادی ضد DNA دو رشته ای در موش های SLE با فرم متوسط و شدید تحت درمان با LZ–SMS بطور قابل توجهی بالاتر از گروه کنترل Balb/c تحت درمان با PBS بوده است، اما غلظت پلاسمایی آنتی بادی ضد DNA دو رشته ای در موش های SLE با فرم متوسط (P < 0.001) و شدید (P = 0.05) بطور معنی داری کمتر از موش های تحت درمان با PBS بوده است.

جدول ۱٫ علائم بالینی موش های Balb/c و MRL/lpr قبل از درمان

MRL/lpr (تعداد : ۳۰) Balb/c
خفیف (تعداد : ۱۰) متوسط (تعداد : ۱۰) شدید (تعداد : ۱۰) سالم (تعداد : ۱۰)
ارزیابی بالینی
وزن بدن (گرم) &48±۸/۷ **۴۹/۴±۹/۱ ۴۸/۷±۴/۱# ۱۹/۲±۰/۲
ضخامت مفاصل (میکرومتر) ۸۴/۳۳/۱ *۸۴/۷±۲/۷ ۸۴/۴±۲/۴ ۷۹/۳±۳/۶
امتیاز فعال بودن لوپوس ۰/۷±۰/۵ ۱±۰/۹ ۱/۳±۱# ۰
امتیاز پروتئینوری ۱/۵±۰/۵ ***۲/۸±۰/۴ ۴±۱/۱### ۰/۷±۰/۶
امتیاز لکوسیتوری ۰/۵±۱/۲ *۲±۱/۴ ۲/۵±۰/۵## ۰
لنفادنوپاتی (درصد) &&&100 ***۱۰۰ ۱۰۰### ۰

& P = 0.03، && P = 0.008، &&& P = 0.0008، مقایسه بین گروه کنترل و موش های SLE فرم خفیف؛ * P = 0.03، **& P = 0.008، *** P = 0.0008، مقایسه بین گروه کنترل و موش های SLE فرم متوسط؛ # P = 0.03، ## P = 0.008، ### P = 0.0008، مقایسه بین گروه کنترل و موش های SLE فرم شدید

شکل ۱٫ علائم بالینی موش های MRL/lpr پس از درمان با LZ–SMS یا PBS. نتایج امتیازدهی پروتئینوری (a)، لکوسیتوری (b)، فعال بودن لوپوس (c)، گلومرولونفریت (d)، نفریت بینابینی (e) و نفوذپذیری رگ (f) در هر ستون به صورت میانگین±انحراف معیار نشان داده شده است. *P < 0.05، **P < 0.01، ***P < 0.001، موش های MRL/lpr تیمار شده با LZ–SMS و PBS؛ &P < 0.05، &&P < 0.01، &&&P < 0.001، موش های کنترل Balb/c و موش های MRL/lpr تیمار شده با PBS؛ ##P < 0.01، ###P < 0.001، موش های کنترل Balb/c و موش های MRL/lpr تیمار شده با LZ–SMS (تعداد: ۵ در هر گروه).

پروفایل بیان ژن برای تمایز سلول های Th

یک لگاریتم رایج بیان ژن نشان داد که میزان بیان سلول های Th1 (Ifng، Il12rb2، Il18r1، Il18rap، Fasl و Tbx21) و سلول های Th در کنار سلول های T تنظیمی (Cacna1f، Chd7، Foxp3، Gata4، Hopx، Hoxa10، Hoxa3، Id2، Ikzf2، Il1r2، Il2ra، Lrrc32، Perp، Pkd2، Tnfrsf9، Trp53inp1، Uts2 و Zeb1) بطور قابل توجهی کمتر از سلول های Th2 (Asb2، Gata3، Il13، Il1rl1، Il4، Il5 و Pparg) در لنفوسیت های CD4+ Th موش های MRL/lpr تیمار شده با PBS در مقایسه با موش های Balb/c تیمار شده با PBS بوده است (شکل a4). با این حال، پس از تیمار با LZ–SMS، سطح بیان سلول های T تنظیمی (iTreg) و T طبیعی (nTreg) (Ccr6، Fosl1، Foxp3، Ikzf2، Il9، Irf4، Irf8، Myb، Nr4a1، Nr4a3، Pou2f2، Rel، Tgif1 و Tnfsf11) که مسئول بیان ژن در لنفوسیت های CD4+ Th طحال موش های MRL/lpr هستند، بطور قابل توجهی بالاتر از سلول های  Th17 (Il17a، Il17re، Il1r1، Il21، Rora و Rorc) و Th1 در مقایسه با گروه های تحت تیمار با PBS بوده است (شکل b4). این نتایج نشان می دهد که LZ–SMS با القای تمایز سلول های CD4+ Th طحال به سلول های iTreg و سرکوب تمایز سلول های Th1 و Th17، نقش تعدیل کنندگی سیستم ایمنی خود را نشان می دهند. بسیاری از عوامل رونویسی مرتبط با تمایز سلول Th از جمله سیتوکین ها و ژن های گیرنده در موش های MRL/lpr تحت تیمار با LZ–SMS در مقایسه با گروه تیمار شده با PBS افزایش یافتند (نسبت >1). این موضوع در مورد ژن های IL-2 و Foxp3 هم صدق می کند، که بیش از ۵/۱ برابر افزایش یافتند (جدول ۲).

شکل ۲٫ اثرات تیمار با LZ–SMS بر بیماری نفریت در موش های MRL/lpr مبتلا به فرم شدید. بافت کلیه موش های MRL/lpr جمع آوری شده و در پارافرمالدهید ۴% فیکس شده است. بافت ها با PAS رنگ آمیزی شدند. هیستوپاتولوژی کلیه موش های SLE تیمار شده با PBS (c-a) و LZ–SMS (f-d) نمایش داده شده است. رنگ امیزی a و d منطقه توبولار کلیه را نشان می دهند. پیکان های سیاه نشان دهنده وجود پروتئین در این ناحیه می باشد. رنگ امیزی b و e اطراف یک رگ خونی را نشان می دهند. پیکان های سیاه نفوذ سلول های تک هسته ای به رگ را نشان می دهند. رنگ امیزی b و e منطقه گلومرولی را نشان می دهند. . پیکان های قرمز نفوذ سلول های تک هسته ای اطراف گلومرول ها را نشان می دهند.

شکل ۳٫ غلظت پلاسمایی ANA و آنتی بادی ضد DNA دو رشته ای در موش های MRL/lpr و Balb/c تحت درمان با LZ–SMS یا PBS. غلظت پلاسمایی ANA (a) و آنتی بادی ضد DNA دو رشته ای (b) بر حسب میانگین±انحراف معیار نمایش داده شده است. * P < 0.05، ** P < 0.01، موش های MRL/lpr تیمار شده با LZ–SMS و PBS. && P < 0.01، &&& P < 0.001، موش های کنترل Balb/c و موش های MRL/lpr تیمار شده با PBS. # P < 0.05، ## P < 0.01، ### P < 0.001، موش های کنترل Balb/c و موش های MRL/lpr تیمار شده با LZ–SMS.

افزایش درصد سلول های Treg +CD4+CD25+Foxp3 و Breg +IL۱۰ در موش های MRL/lpr پس از تیمار با LZ– SMS

ما دریافتیم تعداد سلول های Treg +CD4+CD25+Foxp3 در گروه های مختلف موش های MRL/lpr در مقایسه با گروه کنترل Balb/c هم قبل و بعد از تیمار با LZ–SMS به صورت خطی کاهش یافته است (شکل c5-a5). در مقایسه با گروه تیمار شده با PBS، درصد سلول های Treg +CD4+CD25+Foxp3 طحال، تیموس و سلول های خون محیطی در موش های مبتلا به فرم شدید بیماری SLE تیمار شده با LZ– SMS بطور معنی داری افزایش یافته است (P < 0.05). علاوه براین، درصد سلول های Treg +CD4+CD25+Foxp3 طحال موش های مبتلا به فرم متوسط بیماری SLE تیمار شده با LZ– SMS بطور معنی داری بالاتر از گروه تیمار شده با PBS بوده است (P = 0.004). بر این اساس، نسبت درصد سلول های +CD4+CD25+Foxp3 به درصد سلول های T موثر CD4+CD25 حاصل از طحال، تیموس و سلول های خون محیطی موش های مبتلا به فرم شدید بیماری SLE تیمار شده با LZ– SMS و سلول های تیموس و خون محیطی موش های مبتلا به فرم متوسط بیماری SLE تیمار شده با LZ– SMS بطور معنی داری بالاتر از گروه تیمار شده با PBS بوده است (شکل d5-e5). در نتیجه، افزایش معنی داری در درصد سلول های Breg +IL‑۱۰ حاصل از تیموس موش های مبتلا به فرم خفیف بیماری SLE تیمار شده با LZ– SMS در مقایسه با گروه تیمار شده با PBS مشاهده شد (شکل g5، P < 0.001).

غلظت پلاسمایی سیتوکین های موش های MRL/lpr و Balb/c

غلظت پلاسمایی سیتوکین های التهابی (IFN-γ، TNF-α و IL-6) در موش های مبتلا به فرم متوسط و شدید SLE پس از تیمار با LZ–SMS در مقایسه با گروه تیمار شده با PBS کاهش یافت (شکل ۶). بویژه، غلظت پلاسمایی سیتوکین های IL-21 و IL-17A در موش های مبتلا به فرم شدید SLE پس از تیمار با LZ–SMS بطور قابل توجهی کاهش یافت (شکل c6، f6). در مقابل، غلظت پلاسمایی IL-2 در فرم شدید بیماری (P = 0.004) و غلظت IL-12p70 در تمامی موش های MRL/lpr تیمار شده با LZ–SMS در مقایسه با گروه تیمار شده با PBS بطور معنی داری افزایش یافت (شکل b6، d6) (P < 0.05). علاوه براین، پس از تیمار با LZ–SMS، غلظت پلاسمایی IL-10 در فرم شدید بیماری در مقایسه با گروه تیمار شده با PBS بطور معنی داری کاهش یافت (شکل f6، P = 0.011).

هیچ اختلاف معنی داری در غلظت پلاسمایی IL-27 بین گروه های مختلف موش های تیمار شده با MRL/lpr پس از تیمار با LZ–SMS در مقایسه با گروه PBS وجود نداشته است (شکل e6، P = 0.156)، هر چند غلظت پلاسمایی در موش های مبتلا به فرم متوسط و شدید SLE کمتر از موش های Balb/c بوده است (P < 0.01). با این حال، اختلاف معنی دار (P < 0.01) در غلظت IL-27 در این حالت نمی تواند ارتباط فیزیولوژیکی یا ایمنولوژیکی داشته باشد.

شکل ۴٫ RT2 profiler PCR array در تمایز سلول های Th موش. نتایج بیان ژن سلول های Th1، Th2، iTreg، nTreg و Th17 و سلول های Th همراه با سلول های Treg در موش های MRL/lpr و Balb/c تیمار شده با PBS (a) و موش های MRL/lpr تیمار شده با LZ–SMS و PBS (b) در شکل نشان داده شده است. آزمون Mann–Whitney U به منظور ارزیابی تفاوت بیان mRNA بین ژن های مختلف سلول های Th به کار رفته است. *P < 0.05

بحث

در مطالعه حاضر، ما اثرات ضد التهابی ترکیب LZ–SMS را پس از تجویز خوراکی و داخل صفاقی در موش های MRL/lpr بررسی کردیم. از این ترکیب با حداکثر غلظت ۵۰۰ میلی گرم/کیلوگرم/روز به صورت معلق در PBS می توان استفاده کرد. موش های MRL/lpr این ترکیب را به مدت ۷ روز به صورت خوراکی مصرف کردند و سپس به مدت ۷ روز به شکل داخل صفاقی تزریق شد. نکته قابل توجه این است که هیچ یک از اجزای ترکیب LZ–SMS، بیش از دوز سمی در انسان و موش ها تجویز نشد. موش های MRL/lpr پس از تیمار با LZ–SMS، کاهش علائم مرتبط با بیماری SLE از جمله بهبودی پروتئینوری، لکوسیتوری، نفریت بینابینی و نفوذپذیری رگ ها از خود نشان دادند. موش های مسن مبتلا به SLE (24-20 هفته ای) علائم شدید تری از نفریت لوپوس را قبل از درمان نشان دادند. با افزایش سن در سه گروه مختلف موش های مبتلا به SLE (خفیف، متوسط و شدید)، افزایش علائم و شاخصه های بیوشیمیایی مرتبط با نفریت مشاهده شد.

در مطالعه حاضر، هیچ اطلاعاتی مبنی بر جذب یا توزیع سیستمیک اجزای فعال LZ–SMS وجود ندارد. LZ حاوی ترکیبی بنام β-گلوکان می باشد که یک پلی ساکارید تعدیل کننده سیستم ایمنی بوده و مسئول تعاملات بالقوه با گیرنده های شناسایی الگو مانند دکتین-۱ می باشد. نکته قابل توجه این است که لکتین-۱ یک نوع لکتین نوع c بوده که با همکاری TLR2 سبب بروز پاسخ سیستم ایمنی ذاتی در سلول های عرضه کننده آنتی ژن می شود و همچنین تعادل را بین پاسخ های پیش التهابی و ضد التهابی برقرار می کند. علاوه بر این، TLR2 می تواند به صورت بالقوه موجب افزایش سلول های Treg هم در شرایط آزمایشگاهی و هم مدل حیوانی شود و از این رو، سبب مهار موقت بیان Foxp3 و جلوگیری از بروز عملکرد های سرکوب کننده آن می شود. نشان داده شده است که بیان و عملکرد دکتین-۱ در سلول های تک هسته ای خون محیطی بیماران مبتلا به SLE و RA در مقایسه با افراد سالم ناقص بوده است که بیانگر این موضوع است که دکتین-۱ در پاتوژنز بیماری های خود ایمنی التهابی نقش دارد. دکتین-۱ می تواند سهم قابل توجهی را در گسترش سلول های Treg به خود اختصاص دهد و نقش مهمی در جلوگیری از شرایط پیش التهابی مانند دیابت نوع ۱ ایفا می کند. پروتکل مورد استفاده در تزریق داخل صفاقی این ترکیب درمانی مطابق مصرف خوراکی آن بوده، اما دوز مورد استفاده در تزریق داخل صفاقی تا ۵۰ میلی گرم/کیلوگرم/روز به دلیل حلالیت محدود LZ–SMS کاهش یافته است.

جدول ۲٫ بررسی تمایز سلول های Th به روش PCR

عوامل رونویسی سیتوکین ها و گیرنده ها
ژن LZ–SMS PBS ژن LZ–SMS PBS
Fosl1 ۱/۹۴ Tnf ۰/۹۸
Nr4a1 ۵/۱۲ Il1r2 ۱/۹۴
Nr4a3 ۶/۴۶ Il17re ۱/۱۰
Hoxa10 ۱/۰۶ Il21 ۲/۰۱
Rel ۳/۲۲ Ccr6 ۱/۱۱
Irf4 ۲/۰۳ Csf2 ۰/۷۹
Nfatc1 ۱/۸۸ Il4 ۱/۱۲
Irf8 ۱/۵۷ Il18r1 ۱/۷۸
Id2 ۱/۷۴ Ccr3 ۳/۶۱
Gata4 ۱/۹۹ Ccl5 ۰/۹۶
Rora ۵/۰۴ Il13ra1 ۰/۶۹
Cebpb ۱/۷۲ Il1rl1 ۰/۸۲
Stat1 ۱/۵۸ Il18 ۰/۸۴
Zbtb7b ۰/۸۳ Il2ra ۰/۳۵
Pou2f2 ۱/۴۰ Ccl7 ۰/۷۳
Maf ۲/۱۴ Il18rap ۲/۲۷
Stat6 ۰/۹۷ Ccr4 ۱/۳۴
Rorc ۱/۱۹ Il12p40 ۰/۵۳
Runx1 ۱/۲۹ Il1r1 ۳/۹۰
Gata3 ۱/۶۸ Il2 ۲/۶۳
Zeb1 ۱/۰۳ Ccl11 ۱/۳۸
Nfatc2 ۲/۰۱ Il12rb2 ۲/۶۸
Foxp3 ۱/۹۱ Il4ra ۱/۹۹
Nfatc2ip ۱/۵۳ Il9 ۶/۱۳
Runx3 ۲/۰۰ Il13 ۹۹/۱
Hoxa3 ۱/۲۲
Stat4 ۱/۴۱

کاهش قابل توجه علائم بیماری نفریت در موش های مورد مطالعه پس از درمان با LZ–SMS می تواند به علت توانایی این ترکیب در کاهش بیان ژن های مرتبط با التهاب (مانند Th17)، ژن های Th1، ژن های مرتبط با سیتوکین ها و گیرنده های التهابی، کموکین ها، مولکول های چسبنده و پروتئین های فعال کننده التهاب باشد. این پاسخ ها همچنین می تواند به علت توانایی LZ–SMS در افزایش بیان ژن های مرتبط با iTreg و عوامل رونویسی پایین دست مانند Foxp3، Stat1 و Stat4 باشد. اگرچه مکانیسم عمل فعالیت ضد نفریتی این ترکیب هنوز مشخص نشده است، اما گزارش شده است که گانودرما لوسیدوم در تنظیم تولید برخی سیتوکین های پیش التهابی مرتبط با بیماری زایی SLE در سلول های تک هسته ای خون محیطی نقش دارد.

LZ–SMS مورد استفاده در این مطالعه موجب افزایش درصد سلول های Treg +CD4+CD25+Foxp3 و Breg +IL-10 در موش های SLE در مقایسه با موش های تیمار شده با PBS شده است. مقادیر بالای سلول های Treg می تواند نتایج زیر را به دنبال داشته باشد: ۱) افزایش نسبت سلول های Treg به Teff؛ ۲) افزایش غلظت پلاسمایی IL-2 که افزایش تمایز سلول های Treg را از سلول های naive T، گسترش سلول های Treg در تیموس و بروز نقش تعدیل کنندگی سیستم ایمنی این سلول ها را به دنبال دارد؛ ۳) کاهش قابل توجه برخی سیتوکین های پیش التهابی مانند IL-21، TNF-α، IL-6 و IL-17A. اگرچه ویژگی های فنوتیپی سلول های Treg در موش های MRL/lpr با موش های سالم شبیه بودند، اما عملکرد مهاری این سلول ها در موش های MRL/lpr پس از تیمار با LZ–SMS می تواند مختل شود. بنابراین، روش های عملکردی بیشتری مورد نیاز است تا درک بهتری از نقش TLR2 و دکتین-۱ در سلول های Treg پس از تیمار موش های MRL/lpr مبتلا به SLE با LZ–SMS ایجاد شود. نتایج کلی حاکی از کاهش غلظت پلاسمایی ANA و آنتی بادی ضد DNA دو رشته ای در موش های SLE پس از تیمار با LZ–SMS هستند (شکل ۳)، که نشان می دهد فعالیت مهاری LZ–SMS تنها به سلول های CD4+ Treg محدود نشده و با انتشار سلول های IL-10+ Breg هم مرتبط است. با این حال، مقادیر پایین سلول های IL-10+ Breg در سلول های خون محیطی و کاهش غلظت پلاسمایی IL-10 در موش های مبتلا به فرم شدید SLE پس از تیمار با LZ–SMS می تواند نقش تعدیل کنندگی LZ–SMS در سیستم ایمنی را به علت شدت بیماری محدود کند.

شکل ۵٫ ویژگی سلول های +Treg CD4+CD25+Foxp3 و Breg +IL-10 در موش های MRL/lpr و Balb/c پس از تیمار با LZ–SMS یا PBS. نمودار ها درصد سلول های Treg CD4+CD25+Foxp3+ در طحال (a)، تیموس (b) و سلول های خون محیطی (c)؛ نسبت درصد سلول های Treg CD4+CD25+Foxp3+ به CD4+CD25 Teff در طحال (d)، تیموس (e) و سلول های خون محیطی (f) و درصد سلول های IL-10 + Breg در طحال (g)، تیموس (h) و سلول های خون محیطی (i) را به صورت میانگین ± انحراف معیار نشان می دهند. *P < 0.05، **P < 0.01، ***P < 0.001، تیمار با LZ–SMS و PBS؛ &P < 0.05، &&P < 0.01، &&&P < 0.001، موش های کنترل Balb/c و موش های MRL/lpr تیمار شده با PBS؛ #P < 0.05، ##P < 0.01، ###P < 0.001، موش های کنترل Balb/c و موش های MRL/lpr تیمار شده با LZ–SMS (تعداد: ۵ در هر گروه).

شکل ۶٫ غلظت پلاسمایی سیتوکین های موش های MRL/lpr و Balb/c پس از تیمار با LZ–SMS یا PBS. نمودار ها میانگین غلظت پلاسمایی IFN-γ (a)، IL-12P70 (b)، IL-21 (c)، IL-2 (d)، IL-27 (e)، IL-10 (f)، TNF-α (g)، IL-6 (h) و IL-17A (i) را نشان می دهند. *P < 0.05، **P < 0.01، تیمار با LZ–SMS و PBS؛ &&P < 0.01، &&&P < 0.001، موش های کنترل Balb/c و موش های MRL/lpr تیمار شده با PBS؛ #P < 0.05، ##P < 0.01، ###P < 0.001، موش های کنترل Balb/c و موش های MRL/lpr تیمار شده با LZ–SMS (تعداد: ۵ در هر گروه).

نتیجه گیری

پس از درمان با LZ–SMS، درصد سلول های Treg +CD4+CD25+Foxp3 و Breg +IL-10 در موش های SLE در مقایسه با موش های تیمار نشده، افزایش یافته است. علاوه براین، کاهش غلظت پلاسمایی برخی سیتوکین های التهابی و کاهش بیان ژن های مرتبط با سیتوکین ها پس از تیمار با LZ– SMS مشاهده شد. علائم بالینی موش های مبتلا به SLE پس از تیمار با LZ– SMS، بطور قابل توجهی بهبود یافت.

منبع: ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27134645

Tags

دیدگاهتان را بنویسید

Your email address will not be published.

top