گانودرما لوسیدوم به واسطه مهار فعالیت سلول های میکروگلیا از تخریب اعصاب دوپامینرژیک جلوگیری می کند

چکیده
شواهد فراوانی مبنی بر نقش التهاب عصبی در بیماری پارکینسون (PD) وجود دارد. مطالعات جدید حاکی از آن است که میکروگلیا نقش کلیدی در تخریب عصبی پیشرونده در بیماری پارکینسون دارد و می تواند به عنوان یک هدف درمانی امیدبخش باشد. گانودرما لوسیدوم یکی از گیاهان دارویی چین است که در طب سنتی دارای اثرات بالقوه در حفاظت از سلول های عصبی می باشد و گمان می رود دارای ویژگی های ضد التهابی و حفاظت از سیستم ایمنی باشد. برای آزمودن این فرضیه، ما اثرات بالقوه گانودرما در محافظت سلول های عصبی و مکانیسم عمل آن از طریق مهار فعالیت سلول های میکروگلیا را بررسی کردیم. میکروگلیا توسط لیپوپلی ساکارید (LPS) و +MPP تیمار شده با سلول های۲۳٫۵ MES فعال گردید. در عین حال، عصاره های گانودرما مانع از تولید فاکتور های سیتوتوکسیک و پیش التهابی مشتق شده از میکروگلیا [نیتریک اکسید، فاکتور نکروز تومور آلفا (TNFα)، اینترلوکین ۱β؛ (IL-1β)] به صورت وابسته به دوز و تحت بیان mRNA ژن های TNFα و IL-1β می شود. نتایج مطالعه ما نشان داد گانودرما لوسیدوم می تواند به عنوان عامل ضد التهابی موثر در درمان بیماری پارکینسون باشد.

۱- مقدمه

پارکینسون یک بیماری شایع عصبی می باشد که با علائمی همچون حرکات آهسته، سفتی عضلات، لرزش در وضعیت استراحت و اختلالات تعادل همراه است. با پیشرفت بیماری، بسیاری از بیماران علائم غیر حرکتی مانند اضطراب، افسردگی، یبوست و زوال عقل را تجربه می کنند. اگرچه داروهایی وجود دارند که می تواند علائم بیماری را کاهش دهند اما استفاده مزمن از این داروها نه تنها در جلوگیری از پیشرفت بیماری موثر نیست بلکه با عوارض ناخوشایند همراه است. به همین دلیل تمایل زیادی به توسعه روش های درمانی با هدف کاهش و یا حتی توقف ماهیت پیشرونده بیماری وجود دارد. اگرچه توسعه روش های درمانی جدید به دلیل دانش محدود در زمینه بیماری زایی پارکینسون محدود شده است.

علت تخریب سلول های عصبی در بیماری پارکینسون هنوز مشخص نیست اما شواهد حاکی از آن است که فعال شدن سلول های گلیا و فعالیت های التهابی منجر به اتفاقاتی می گردد که تخریب پیشرونده سلول های عصبی را به همراه دارد. تعداد زیادی سلول های میکروگلیا فعال شده در مجاورت نورون های تخریب شده در توده سیاه بیماران مبتلا به پارکینسون وجود دارد. در مغز انسان سالم، میکروگلیا ها در یک حالت استراحت و راکد وجود دارند و بر محیط مغز نظارت می کنند. در پاسخ به محرک های غیر طبیعی مانند سموم محیطی و سموم عصبی، میکروگلیا فعال شده و با تولید فاکتور های سیتوتوکسیک مانند نیتریک اکسید (NO) ؛ TNFα و IL-1β، سوپرکسید و غیره موجب تحریک شدید اثرات نوروتوکسیک می شود.

از حدود ۱۰۰۰ سال پیش، گانودرما لوسیدوم به عنوان یک داروی تقویتی در چین استفاده می شد. مطالعات نشان داده که عصاره گانودرما لوسیدوم دارای ترکیباتی می باشد که می تواند در تقویت سیستم ایمنی، کاهش التهاب، افزایش تولید انرژی در میتوکندری و به دام انداختن رادیکال های آزاد موثر باشد. مطالعه قبلی نشان داد عصاره های گانودرما می توانند مانع از بین رفتن سلول های عصبی بعد از سکته مغزی شوند. اما مشخص نشده که آیا گانودرما لوسیدوم می تواند در کاهش تخریب سلول های عصبی دوپامینرژیک و کاهش پاسخ التهابی سلول های گلیا به محرک های درونی و بیرونی موثر است یا خیر. این مطالعه به منظور پاسخ به پرسش اخیر انجام شده است.

۲- مواد و روش کار

۲-۱- مواد. مقداری پودر قارچ گانودرما تهیه گردید. عصاره ها از fruiting body (اندام بارده) گیاه و به کمک متانول در دمای پایین استخراج شد. ترکیبات اصلی گانودرما لوسیدوم شامل پلی ساکارید ها، تری ترپن ها و ارگوسترول بود. عصاره های گانودرما با توجه به میزان پلی ساکارید ها و ارگوسترین تعریف شدند. طبق محاسبات،  بازده استخراج پلی ساکارید موجود در اندام بارده حدود ۰/۶ درصد (وزنی/وزنی) و میزان ارگوسترول ۰/۳۵ درصد بود. گانودرما لوسیدوم در محلول نمکی فسفات حل شد. واکنشگر های کشت سلولی از شرکت گیبکو (Gibco) آمریکا و دوپامین از شرکت پرکین المر (PerkinElmer)، لیپوپلی ساکارید ها و معرف گریس از شرکت سیگما خریداری شدند. پادتن های تک تیره یا مونوکلونال علیه آنتی ژن CD11b موش از شرکت Serotec انگلیس، کیت سنجش الایزا TNFα موش از شرکت دیاکلون (Diaclone) فرانسه، کیت الایزا IL-1β و سوپراکسید از شرکت Dojindo ژاپن و معرف های واکنش PCR از شرکت Takara ژاپن تهیه شدند.

۲-۲-محیط های کشت میکروگلیا و سلول های MES 23.5. میکروگلیا از مغز موش های صحرایی ۱۲-۲۴ ساعته نژاد ویستار جداسازی شد. این مطالعه با توجه به بیانیه هلسینکی و به کمک کتاب “راهنمای استفاده از حیوانات آزمایشگاهی” انجام شد. تمام روش های تجربی توسط کمیته بازبینی دانشگاه علوم پزشکی پایتخت مورد بررسی قرار گرفت. به طور خلاصه، بعد از تشریح مغز و جدا کردن مننژیت، بافت خرد شده و توسط تریپسین به مدت ۲۰ دقیقه در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد هضم و با پیپت پاستور برداشته و از فیلتر سلولی نایلونی ۲۰۰ میکرومتری عبور داده شد. پس از سانترفیوژ به مدت ۵ دقیقه در دور ۱۲۱، بافت در محیط کشت  DMEM حاوی ۱۰ درصد سرم جنینی گاوی (FBS) معلق و در فلاسک های ۷۵ سانتی متر مربعی به تعداد ۱۰۵×۵ سلول در هر میلی لیتر از یک فلاسک کشت داده شد. دو هفته بعد از کشت، فلاسک ها به مدت چهار ساعت با دور ۱۸۰ در دقیقه سانترفیوژ گردید و سلول های شناور دوباره جمع آوری شده و به مدت ۵ دقیقه با دور ۸۰۰ در دقیقه سانترفیوژ شدند. سپس به منظور آزمایشات بعدی در پلیت های ۹۶ خانه ای منتقل شدند.

رده سلولی دوپامینرژیک MES 23.5 هدیه ای از پروفسور Wei-dong از دپارتمان اعصاب دانشکده Baylor آمریکا می باشد. سلول های MES 23.5 از ادغام سلول های مزانسفالیک جنینی موش صحرایی با سلول های نوروبلاستما N18TG2 می باشد. سلول های MES 23.5 می تواند مزیت هایی را برای چنین مطالعات اولیه ای به دنبال داشته باشد همچون یکنواختی بیشتر نسبت به محیط کشت های اولیه، حساسیت به سمیت حاصل از رادیکال آزاد و مرگ سلولی وابسته به کلسیم. سلول های MES 23.5 به تعداد ۱۰۴ در پلیت های ۲۴ خانه ای پوشیده شده از پلی لیزین کشت و در DMEM نگهداری شد. سپس در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد با ۵ درصد CO2 و ۹۵ درصد رطوبت انکوبه شد. بعضی از سلول های MES 23.5 با میکروگلیا ها با هم کشت داده شدند.

به منظور بررسی تعامل بین میکروگلیا های واکنش دهنده با سلول های MES 23.5 از کشت همزمان آن ها در پلیت های ۲۴ خانه ای استفاده شد. به طور خلاصه، میکروگلیا های خالص به تعداد ۱۰۴ در هر چاهک یک روز قبل از افزودن سلول های MES 23.5 به نسبت ۲ به ۱ (MES 23.5 به میکروگلیا) کشت داده می شود. محیط کشت های مشترک در محیطی شامل ۲ درصد FBS غیرفعال شده توسط گرما نگهداری شدند. محیط کشت های حاوی میکرو گلیا یا سلول های MES 23.5 به تنهایی یا با هم به مدت ۲۴ ساعت با لیپوپلی ساکارید (LPS, 0.25 μg/ml) به عنوان کنترل مثبت، عصاره های گانودرما لوسیدوم (۵۰–۴۰۰ μg/ml) یا اجزای غشای سلولی MES 23.5 تیمار شدند.

۲-۳- ایمنی شناسی شیمیایی سلول. همانطور که قبلا شرح داده شد محیط کشت ها توسط پارافرمالدهید ثابت شدند. میکروگلیا ها توسط آنتی بادی های مونوکلونال OX-42 رنگ آمیزی شدند. به طور خلاصه، محیط کشت های سلولی به مدت ۱۵ دقیقه با H2O2 تیمار شده و سپس توسط سرم نرمال سالین متوقف شده و به مدت یک شبانه روز در دمای ۴ درجه سانتی گراد با آنتی بادی های اولیه انکوبه شدند. بعد از انکوباسیون با یک آنتی بادی ثانویه بیوتینیله و سپس معرف ABC، کمپلکس تشکیل شده توسط ۳، ۳ʹ-دی آمینو بنزیدین (DAB) رنگ آمیزی شد. تصاویر توسط میکروسکوپ معکوس نیکون ثبت شد.

۲-۴- آماده سازی غشای سلولی MES 23.5. پس از قرار گرفتن در معرض +۱۰μM MPP به مدت ۲۴ ساعت، سلول های MES 23.5 در یک بافر شامل ساکاروز ۰٫۲۵M ؛ PBS100mM ؛MgCl۱mM ؛ EDTA 1Mm و مهار کننده پروتئاز PMSF 2μM قرار گرفته و سپس هموژن گردید. محلول همگن شده در دور ۸۰۰۰ در دقیقه به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی گراد سانتریفیوژ می گردد تا اجزای ناخالص هسته حذف شود. محلول رویی دوباره در دور ۱۰۰۰۰۰ به مدت ۶۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی گراد سانریفیوژ گردید. رسوب تشکیل شده هم هموژن شده و در محیط کشت به صورت معلق در آمده و به عنوان بخشی از غشای عصبی استفاده گردید.

۲-۵- روش جذب دوپامین. سلول های هر چاهک توسط بافر کربس-رینگر (NaH2PO4  ۱۶mM ؛ Na2HPO4 16mM ؛ NaCl 119 mM ؛ KCl 4.7 mM ؛ CaCl2 1.8 mM ؛ MgSO4 1.2 mM ؛ EDTA 1.3 mM  ؛ گلوکز ۵٫۶mM) شسته شدند. سلول ها سپس با دوپامین ۱۰nM در بافر کربس-رینگر (۱۰ μl در هر چاهک) به مدت ۳۰ دقیقه در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه شدند. جذب غیر اختصاصی دوپامین در چاهک های موازی شامل دوپامین و نومیفنسین (nomifensine 1mM) که یک مهار کننده جذب بالای دوپامین می باشد، تشخیص داده شد. سپس سلول ها سه بار با محلول کربس-رینگر سرد شسته شده و توسط NaOH 1N لیز شدند. بعد از مخلوط کردن محلول حاصل با ۳ میلی لیتر مایع سنتیلاسیون در طول یک شبانه روز، میزان پرتوزایی آن توسط اشکارساز های لومینسانس (ساخت آمریکا) مورد سنجش قرار گرفت. میزان جذب اختصاصی هم از کم کردن میزان جذب غیر اختصاصی از فعالیت کل تعیین شد.

۲-۶- روش نیتریک اکسید. تولید نیتریک اکسید با اندازه گیری واکنش متابولیت های حاصل از آن (نیترات و نیتریت) با معرف گریس سنجیده شد. پس از قرار گرفتن در معرض لیپوپلی ساکارید به مدت ۲۴ ساعت، محیط کشت ها جمع آوری شده و سانتریفیوژ شدند. محیط کشت ها با حجم مشخصی از معرف گریس در دمای اتاق به مدت ده دقیقه انکوبه شدند و سپس جذب نوری نمونه ها با استاندارد های مناسب در طول موج ۵۴۰ نانومتر توسط دستگاه الایزا ریدر (Marne-la-Coquette, France) ثبت شد.

۲-۷- روش TNFα، IL-1β و سوپراکسید. نمونه ها مشابه نمونه های نیتریک اکسید آماده شدند و تولید این فاکتور ها با استفاده از کیت TNFα موش، کیت الایزا IL-1β موش و کیت WST سوپراکسید با توجه به دستورالعمل های شرکت سازنده آن ها انجام شد. سپس میزان جذب در طول موج ۴۵۰ نانومتر خوانده شد.

۲-۸- استخراج RNA و آزمایش RT-PCR. استخراج کل RNA از سلول های میکروگلیا اولیه با استفاده از کیت استخراج RNA طبق دستورالعمل شرکت سازنده انجام شد. RNA طی واکنش رونویسی معکوس با استفاده از آنزیم ترانس کریپتاز معکوس به cDNA تبدیل گردید. برای انجام PCR، از cDNA حاصل با استفاده از کیت SYBR Premix Ex Taq  که شامل رنگ سایبرگرین و ۰٫۲μM از پرایمر مورد نظر می باشد، استفاده شد. PCR با استفاده از دستگاه DNA Engine Opticon انجام شد. پس از دناتوره کردن اولیه به مدت ۱۰ ثانیه در ۹۵ درجه سانتی گراد، واکنش در ۳۵ سیکل به مدت ۵ ثانیه در دمای ۹۵ درجه سانتی گراد، ۳۰ ثانیه در دمای ۶۰ درجه سانتی گراد و ۱ ثانیه در دمای ۸۰ درجه سانتی گراد ادامه یافت. به منظور اطمینان حاصل کردن از این که محصولات حاصل از واکنش دارای دمای مناسب و برابر هستند، منحنی ذوب رسم شد. پرایمر های اختصاصی مورد استفاده در جدول ۱ ذکر شده است. اندازه گیری رونوشت های تولید شده با استفاده از رسم منحنی کالیبراسیون انجام گرفت. از ژن β-actin به عنوان ژن کنترل داخلی استفاده شد. داده های ژن مورد آزمایش با داده های ژن β-actin نرمال شد.

۲-۹- آنالیز آماری. داده ها بر حسب میانگین ± انحراف معیار بیان شدند. تحلیل واریانس با روش آنالیز واریانس با استفاده از نرم افزار SPSS انجام گردید. P < 0.05 نشان دهنده اختلاف معنی دار می باشد.

۳- نتایج

۳-۱-فعال سازی میکروگلیا توسط LPS  و غشای سلولی دوپامینرژیک +MPP. برای ایجاد الگوی فعال سازی میکروگلیا، LPS و +MPP در محیط کشت های میکروگلیا یا سلول های عصبی دوپامینرژیک (رده سلولی ۲۳٫۵) و به صورت کشت همزمان قرار گرفتند. سلول های میکروگلیا توسط آنتی بادی های مونوکلونال OX-42 رنگ آمیزی شدند. خلوص محیط کشت میکروگلیا ۹۵% تخمین زده شد. میکروگلیا غیرفعال به صورت منشعب دو قطبی یا چند قطبی در شکل ۱(a) و ۱(b) نمایش داده شده است. فرم آمیبی فعال میکروگلیا در اشکال ۱(c) و ۱(d) نشان داده شد.

a

b

c

d

. شکل ۱: شکل ظاهری میکروگلیا های رنگ آمیزی شده با OX-42. میکروگلیاهای موش صحرایی به مدت ۲۴ ساعت انکوبه شدند. میکروگلیا ها بعد از تیمار شدن با LPS به شکل آمیبی درآمدند. تصاویر با مقیاس ۱۰۰ μm تهیه شدند.

در میان فاکتور های متعدد عصبی، نیتریک اکسید، TNF-α ؛ IL-1β و سوپراکسید می توانند جزو مهمترین واسطه های تخریب اعصاب دوپامینرژیک در نتیجه فعال سازی میکروگلیا باشند. در ابتدا به منظور بررسی فعالسازی میکروگلیا توسط LPS، میزان سطوح فاکتور های  TNF-αو IL-1β (دو سیتوکین منعکس کننده فعال شدن میکروگلیا) و تعدادی از گونه های فعال اکسیژن (ROS، نیتریک اکسید و سوپراکسید) آزاد شده از میکروگلیا های فعال اندازه گیری شدند. میکروگلیا های تحریک نشده هم مقداری سیتوکین تولید می کنند که بسیار ناچیز است. بعد از قرار گرفتن در معرض LPS 0.25μg/ml ، مقدار فاکتور های TNF-αو IL-1β به میزان ۱۱-۶ برابر و مقدار نیتریک اکسید و سوپراکسید به میزان ۱۱-۵ برابر در محیط کشت افزایش یافت (شکل ۲). از آنجایی که سلول های MES 23.5 موجب فعال شدن میکروگلیا ها بعد از تیمار با +MPP می شوند، تاثیر اجزای غشای سلولی MES 23.5 (CF) بر فعال سازی میکروگلیا را بررسی کردیم. در نتیجه انکوباسیون اجزای غشای سلولی  MES 23.5(150 μg/ml)، میزان تولید فاکتور های TNF-αو IL-1β حدود ۱۰-۴ برابر افزایش یافت (شکل ۲).  مقادیر نیتریک اکسید و سوپراکسید حاصل از قرار گرفتن در معرض +MPP در محیط کشت به میزان ۱۰-۲ برابر افزایش یافت (شکل ۲). غشای سلولی تیمار نشده با +MPP یا تیمار شده با گانودرما لوسیدوم کمترین تاثیر را در فعالسازی میکروگلیا داشتند(داده ها ارائه نشده است).

۳-۲- گانودرما لوسیدوم از تولید فاکتور های پیش التهابی و گونه ROS مشتق شده از میکروگلیا جلوگیری می کند. در نتیجه فعالسازی، میکروگلیا ها تولید سیتوکین می کنند. به منظور تشریح مکانیسم محافظتی گانودرما لوسیدوم، تاثیر گانودرما بر مقادیر سیتوکین های التهابی و ROS مشتق شده از میکروگلیا بررسی شد. محیط کشت های میکروگلیا با دوز های مختلف گانودرما لوسیدوم (۵۰-۴۰۰ μg/ml) به مدت۳۰ دقیقه پیش تیمار شدند و سپس در معرض LPS و +MPP قرار گرفتند. همانطور که در شکل ۳ و ۵ مشخص شده است، دوز پایین (۵۰ μg/ml) گانودرما لوسیدوم کمترین تاثیر ممانعت کنندگی را داشته اما دوز های بالا (۱۰۰-۴۰۰ μg/ml) به مقدار زیادی تولید نیتریک اکسید و سوپراکسید دیسموتاز را کاهش داد. دوز بالاتر از ۴۰۰ μg/ml هم نقش ممانعت کنندگی کامل در تولید نیتریک اکسید داشت. در غلظت های مشابه، گانودرما لوسیدوم بعد از تیمار با LPS و +MPP به طور قابل توجهی تولید فاکتور های TNF-αو IL-1β کاهش داد (شکل ۶).

. شکل ۲: طی فعالسازی میکروگلیا، LPS و CF تولید سیتوکین می کنند. فعالسازی میکروگلیا ها با اندازه گیری TNF-α؛  IL-1β، نیتریک اکسید و سوپراکسید بعد از قرار گرفتن در معرض LPS 0.25 μg/ml و CF 150 μg/ml سنجیده شد. مقادیر TNF-α؛  IL-1β، نیتریک اکسید و سوپراکسید در نمونه های کنترل به ترتیب برابر با ۱۰۶٫۵۵pg/ml ؛ ۱۱۹٫۰۹pg/ml ؛  ۰٫۶Μm و ۵٫۲۲U/ml بود. مقادیر تمامی سیتوکین ها به طور معنی داری افزایش یافت (*P < 0.05).

. شکل ۳: گانودرما لوسیدوم از تولید نیتریک اکسید (NO) تحریک شده با LPS یا CF محافظت می کند. محیط کشت ها قبل از قرار گرفتن در معرض LPS 0.25 μg/ml و CF 150 μg/ml با غلظت های مشخص گانودرما لوسیدوم به مدت ۳۰ دقیقه تحت تیمار قرار گرفتند. آزمایشات در سه بار تکرار انجام شد و داده ها بر حسب میانگین ± انحراف معیار بیان شدند. P < .01 نشان دهنده کشت های تیمار شده با LPS و P < .05∗∗ نشان دهنده کشت های تیمار شده با CF می باشد.

۳-۳- گانودرما لوسیدوم از تخریب اعصاب دوپامینرژیک در حضور و عدم حضور میکروگلیا محافظت می کند. به منظور ارزیابی سمیت عصبی ناشی از التهاب، سلول های MES 23.5 دوپامینرژیک در معرض +۱۰۰μM MPP  یا LPS 0.25 μg/ml در حضور یا عدم حضور میکروگلیا به مدت ۲۴ ساعت قرار گرفتند و سمیت عصبی به کمک روش جذب دوپامین سنجیده شد. قرار گرفتن در معرض +MPP منجر به کاهش ۶۶ درصدی در سلول های MES 23.5 به تنهایی و کاهش ۷۴ درصدی سلول های MES 23.5 و میکروگلیا با هم شد (شکل ۷). پیش تیمار کردن با گانودرما لوسیدوم (۴۰۰ μg/ml) موجب کاهش ۳۵% و ۳۸% جذب دوپامین به ترتیب در غیاب و حضور میکروگلیا گردید.

۳-۴- گانودرما لوسیدوم از تخریب اعصاب دوپامینرژیک تحریک شده با LPS در حضور میکروگلیا محافظت می کند. زمانی که کشت همزمان میکروگلیا در معرض LPS 0.25 μg/ml به مدت ۲۴ ساعت قرار گرفت، میزان جذب دوپامین حدود ۵۰ درصد کاهش یافت (شکل ۴). پیش تیمار کردن کشت ها با گانودرما لوسیدوم (۴۰۰ μg/ml) باعث کاهش طور قابل توجهی در جذب دوپامین شد (۲۲% کاهش به همراه گانودرما در مقابل ۵۰% کاهش بدون گانودرما).

۳-۵- گانودرما لوسیدوم از افزایش بیان TNF-α و IL- 1β تحریک شده با LPS و +MPP جلوگیری می کند. سنتز تمام این فاکتور های پیش التهابی طی چند مرحله کنترل می شود. در حالی که مکانیسم های پس از رونویسی، ترجمه و پس از ترجمه نقش مهمی ایفا می کنند، رونویسی ژن محل اولیه تنظیم می باشد. میزان بیان TNF-α و IL- 1β در نمونه های کنترل به سختی قابل تشخیص بود ولی به طور قابل توجهی در سلول های تحریک شده با LPS و +MPP افزایش یافت. پیش تیمار کردن سلول ها با گانودرما لوسیدوم (۱۰۰-۴۰۰ μg/ml) موجب ممانعت از بیان ژن در یک روش وابسته به دوز شد. دوز بالاتر از ۴۰۰ μg/ml تا ۹۰% خاصیت ممانعت کنندگی از خود نشان داد (شکل ۸).

. شکل ۴: گانودرما لوسیدوم موجب کاهش جذب دوپامین در سلول های MES 23.5 تحریک شده با LPS در حضور یا عدم حضور میکروگلیا می شود. محیط کشت ها با ۰٫۲۵ μg/ml LPS و ۴۰۰ μg/ml گانودرما لوسیدوم تیمار شدند. گانودرما ۳۰ دقیقه قبل از قرار گرفتن در معرض LPS تیمار شد. روش جذب دوپامین در بخش روش کار توضیح داده شد. تمامی آزمایشات در دو بار تکرار انجام و به صورت درصد بیان شد.

P < 0.05 نشان دهنده سلول MES 23.5 در حضور و عدم حضور میکروگلیا بدون قرار گرفتن در معرض LPS است. #P < 0.01 نشان دهنده هم کشتی سلول MES 23.5 و میکروگلیا بدون قرار گرفتن در معرض گانودرما است.

. شکل ۵: گانودرما لوسیدوم از تولید سوپراکسید تحریک شده با LPS یا CF در یک روش وابسته به دوز جلوگیری می کند. محیط کشت ها قبل از قرار گرفتن در معرض LPS 0.25 μg/ml و CF 150 μg/ml با غلظت های مشخص گانودرما لوسیدوم به مدت ۳۰ دقیقه تحت تیمار قرار گرفتند. تولید سوپراکسید به روش سوپراکسید دیسموتاز با استفاده از کیت WST اندازه گیری شد. آزمایشات در سه تکرار و بر حسب میانگین ± انحراف معیار بیان شدند. P < 0.001نشان دهنده کشت های تیمار شده با LPS و P < 0.05∗∗ نشان دهنده کشت های تیمار شده با CF هستند.

. شکل ۶: گانودرما لوسیدوم از تولید TNF-α و IL- 1β تحریک شده با LPS یا CF در یک روش وابسته به دوز جلوگیری می کند. محیط کشت ها قبل از قرار گرفتن در معرض LPS 0.25 μg/ml و CF 150 μg/ml با گانودرما لوسیدوم به مدت ۳۰ دقیقه تحت تیمار قرار گرفتند. روش TNF-α و IL- 1β در بخش روش کار شرح داده شد. آزمایشات در سه تکرار و بر حسب میانگین ± انحراف معیار بیان شدند. P < 0.05و P < 0.001** به ترتیب نشان دهنده TNF-α تیمار شده با LPS و CF می باشند. #P < 0.001 و P < 0.001##به ترتیب نشان دهنده IL- 1β تیمار شده با LPS و CF هستند.

۴- بحث

در مطالعه اخیر نشان داده شد گانودرما لوسیدوم به طور موثری از آسیب التهابی اعصاب دوپامینرژیک ناشی از فعالسازی میکروگلیا بعد از قرار گرفتن در معرض LPS و +MPP جلوگیری می کند. مکانیسم احتمالی آن به توانایی گانودرما لوسیدوم در برابر تولید فاکتور های سمی حاصل از میکروگلیا بر می گردد (نیتریک اکسید، TNF-α؛ IL- 1β و سوپراکسید). مشاهده شده است که گانودرما لوسیدوم به طور قابل توجهی بیان TNF-α و IL- 1β را کنترل می کند.

بیماری پارکینسون در نتیجه تخریب پیشرونده توده سیاه مغز به وجود می آید که فعال شدن میکروگلیا را به همراه دارد. اگرچه به نظر می رسد سموم درونی و محیطی منجر به مرگ سلول های عصبی می شوند اما مکانیسم اصلی فعال شدن میکروگلیا هنوز مشخص نیست. نشان داده شد که لیپوپلی ساکارید ها و سموم عصبی می توانند منجر به فعال شدن میکروگلیا شوند که تخریب پیشرونده سلول های عصبی را به همراه دارند اما با ممانعت از بیان فاکتور های پیش التهابی می توان از پیشرفت این روند جلوگیری کرد. شواهد زیادی در زمینه وجود التهاب مزمن در بیماری های دژنراتیو عصبی از جمله پارکینسون وجود دارد.

میکروگلیا ها (سلول های ایمنی ساکن سیستم عصبی مرکزی) نقش مهمی در فرایند التهابی سلول های عصبی ایفا می کنند. میکرو گلیا ها می توانند فعال شوند و طی دو مکانیسم موجب سمیت عصبی شوند. ابتدا میکروگلیا ها با شناسایی عوامل التهابی مانند LPS و سایر سموم عصبی فعال شده و تولید فاکتور های پیش التهابی و سیتوکین می کنند. در نتیجه این فاکتور ها منجر به کاهش ذخایر آنتی اکسیدانی دوپامین، اختلال در عملکرد میتوکندری، مهار بازجذب گلوتامات و آسیب به سیستم عصبی مرکزی می شوند. علاوه بر این، سیتوکین هایی مانند TNF-α موجب فعال شدن سایر میکروگلیاهای خاموش و تقویت واکنش های التهابی می شوند و به صورت خودبخودی ورود رادیکال های سوپراکسید، نیتریک اکسید و ROS را به همراه دارند. فعال شدن میکروگلیا های وابسته به TNF-α باعث ایجاد یک محیط استرس اکسیداتیو از طریق فعال شدن آنزیم NADPH اکسیداز می شود. نشان داده شد IL-1β با ایجاد اختلال در سد خونی-مغزی و به دنبال آن تسهیل ورود گلبول های سفید به سیستم عصبی مرکزی، موجب التهاب سیستم عصبی مرکزی می شوند. نیتریک اکسید یک ترکیب نفوذ پذیر غشا بوده که ذخیره بیش از حد آن منجر به واکنش با سوپراکسید شده و تولید رادیکال پراکسی نیتریت می کند. پراکسی نیتریت ها می توانند به پروتئین ها، لیپید ها و DNA حمله کنند و موجب از بین رفتن سیستم دفاعی آنتی اکسیدانی شوند. بسیاری از رادیکال های مشتق شده از میکروگلیا مانند سوپراکسید به تنهایی قادر به عبور از غشای سلولی نیستند و بعید است این ترکیبات خارج سلولی موجب سمیت عصبی درونی شوند اما سوپراکسید به سرعت می تواند با نیتریک اکسید در فضای خارج سلولی واکنش دهد و تولید یک عامل اکسید کننده قوی کند که به راحتی از غشای سلولی عبور کرده و منجر به آسیب عصبی درونی می شود. تمامی این فاکتور ها منجر به فعال شدن فاکتور رونویسی NF- κB می شود که افزایش تولید ژن های پرو آپوپتوتیک و در نتیجه مرگ سلول های عصبی را به دنبال دارد. طی مکانیسم دوم، میکرو گلیا ها در پاسخ به آسیب سلول های عصبی، بیش از حد فعال شده که برای سلول های عصبی مجاور سمی بوده و منجر به یک چرخه مرگ عصبی دائم می شوند. مطالعات مختلف نشان می دهد که دوپامین های آسیب دیده تولید ماتریکس های متالوپروتئیناز ۳ (MMP3)، پروتئین آلفا-سینوکلئین و نوروملانین می کنند که باعث فعال شدن میکروگلیا و تخریب نورون ها در بیماری پارکینسون می شود. تمامی این فرایند ها منجر به تشکیل یک سیکل معیوب می شود که تخریب پیشرونده سلول های عصبی را به دنبال دارد (شکل ۹).

. شکل ۷: گانودرما لوسیدوم از کاهش جذب دوپامین در سلول های MES 23.5 تحریک شده با +MPP در حضور و عدم حضور میکروگلیا محافظت می کند. محیط کشت ها با +MPP 100 μM و ۴۰۰ μg/ml گانودرما لوسیدوم تیمار شدند. گانودرما ۳۰ دقیقه قبل از قرار گرفتن در معرض +MPP تیمار شد. روش جذب دوپامین در بخش روش کار شرح داده شد. آزمایشات در سه تکرار انجام و داده ها بر حسب درصد بیان شد.

P < 0.001 نشان دهنده سلول های MES 23.5 در حضور و عدم حضور میکروگلیا بدون قرار گرفتن در معرض +MPP می باشد. P < 0.05∗∗ نشان دهنده سلول های MES 23.5 تیمار شده با +MPP در محیط کشت بدون میکروگلیا و P < 0.001 #  نشانگر سلول های MES 23.5 در حضور و عدم حضور میکروگلیا بدون قرار گرفتن در معرض گانودرما لوسیدوم می باشد.

. شکل ۸: گانودرما لوسیدوم از بیان بیش از حد فاکتور های TNF-α (شکل a) و IL-1β (شکل b) تحریک شده توسط LPS یا CF در یک روش وابسته به دوز جلوگیری می کند. محیط کشت ها قبل از قرار گرفتن در معرض LPS 0.25 μg/ml و CF 150 μg/ml با گانودرما لوسیدوم به مدت ۳۰ دقیقه تحت تیمار قرار گرفتند. RNA استخراج شده مطابق روش کار ذکر شده به منظور انجام PCR مورد استفاده قرار گرفت. داده ها به شکل درصد  و بر حسب میانگین ± انحراف معیار بیان شدند. P < 0.05نشانگر به ترتیب کشت های تیمار شده با LPS و CF هستند.

. شکل ۹: مکانیسم مولکولی بین فعال شدن میکروگلیا و مرگ سول عصبی. میکروگلیا ها توسط عوامل التهابی مانند LPS و سایر سموم فعال شده و در نتیجه تولید فاکتور های پیش التهابی و سیتوکین می کنند که از یک طرف باعث تشکیل رادیکال های ROS، نیتریک اکسید و سوپراکسید شده و از طرف دیگر موجب فعال شدن سایر میکروگلیاهای خاموش می شوند. میکروگلیا های وابسته به TNF-α باعث ایجاد یک محیط استرس اکسیداتیو از طریق فعال شدن آنزیم NADPH اکسیداز می شود. IL-1β با ایجاد اختلال در سد خونی-مغزی موجب تسهیل ورود گلبول های سفید به سیستم عصبی مرکزی می شوند. تمامی این فاکتور ها منجر به فعال شدن فاکتور رونویسی NF- κB می شود که افزایش تولید ژن های پرو آپوپتوتیک و در نتیجه مرگ سلول های عصبی را به دنبال دارد. گانودرما لوسیدوم با توجه به اثرات ضد التهابی خود از تولید فاکتور های سمی مشتق شده از میکروگلیا جلوگیری می کند.

در کشت های اولیه غنی شده با نورون یا هم کشتی های نورون و میکروگلیا مشتق شده از مزنسفالون موش صحرایی، تخریب اعصاب دوپامینرژیک تحریک شده با روتنون به حضور سلول های میکروگلیا بستگی داشت. این عملکرد به واسطه تولید سوپراکسید از میکروگلیا فعال شده صورت گرفت. تزریق LPS به ناحیه فوقانی توده سیاه مغز موش صحرایی، منجر به تکثیر سلول های میکروگلیا و آستروگلیا گردید که این سلول های گلیای فعال عوامل مهمی در مرگ سلول عصبی بودند. علاوه براین، مهار فعالسازی سلول های گلیا مغز موش به وسیله جلوگیری از تولید iNOS و IL-1 موجب کاهش سمیت عصبی القا شده توسط MPTP شد. نتایج مطالعه حاضر نشان می دهد مکانیسم ضد التهابی گانودرما لوسیدوم به مهار تولید فاکتور های سمی مشتق شده از میکروگلیا بر می گردد. مکانیسم احتمالی فعالسازی میکروگلیا و آسیب سلول های عصبی در شکل ۹ نشان داده شده است.

گانودرما لوسیدوم یک قارچ دارویی طبیعی در چین می باشد که استفاده از آن به حدود ۱۰۰ سال بعد از میلاد مسیح بر می گردد. از لحاظ بالینی موجب کاهش کلسترول، تقویت حافظه و ضد پیری می باشد. از لحاظ تجربی هم ویژگی های ضد التهابی، تقویت کننده سیستم ایمنی، ضد اکسیداسیون، ضد تومور و اثرات حفاظتی از سیستم عصبی آن نشان داده شده است. تیمار با گانودرما لوسیدوم منجر به افزایش واکنش پذیری میتوژنی با فیتوهماگلوتنین، سلول های CD3؛ CD4؛ CD8 و CD56، لنفوسیت ها، غلظت های پلاسمایی اینترکولین IL)-2)؛ IL-6 و اینترفرون و سلول های NK شد ولی غلظت های پلاسمایی IL-1 و TNF- α در بیماران مبتلا به سرطان کاهش یافت. مطالعات همچنین نشان داد تجویز روزانه گانودرما لوسیدوم (۱ بار در روز طی ۱۵ روز) به طور موثری موجب افزایش دهیدروژنه شدن چرخه کربس و افزایش فعالیت زنجیره انتقال الکترون در میتوکندری موش های مسن گردید. ویژگی های موثر عصاره ها می تواند به خواص آنتی اکسیدانی بالای گانودرما لوسیدوم مرتبط شود.

مهمترین ترکیبات تشکیل دهنده فعال گانودرما لوسیدوم شامل پلی ساکارید ها و تری ترپنوئید ها است. پلی ساکارید ها به ویژه بتا-دی-گلوکان با محافظت از سیستم ایمنی و مهار تشکیل رگ های جدید در تومور، اثرات ضد توموری ویژه ای دارد. علاوه بر این، پلی ساکارید ها نقش محافظتی قابل توجهی علیه رادیکال های آزاد داشته و در نتیجه باعث کاهش آسیب سلولی توسط این عوامل جهش زا می شوند. تری ترپنوئید ها دارای اثرات آنتی اکسیدانی، محاظت از کبد، ضد فشارخون، کاهش کلسترول و ضد حساسیت هستند. با این حال شناسایی ترکیبات فعال موثر در مطالعه حاضر نیاز به بررسی بیشتری دارد.

موثرترین روش درمانی حاضر برای بیماری پارکینسون، تزریق لوودوپا (levodopa) می باشد که اثرات آن با پیشرفت بیماری کاهش می یابد. این دارو در راهکار های حفاظت از سلول های عصبی نقش مهمی دارد. شواهد حاکی از آن است طیف وسیعی از گیاهان چینی یا عصاره های گیاهی مانند پلی فنول های موجود در چای سبز، جینسنوزید، گیاه جینکو و پلی ساکارید ها توانایی جلوگیری از تخریب نورون های دوپامین و علائم حاصل از آن را دارند. همچنین مطالعات نشان داده که گیاهان چینی یا عصاره های گیاهی به دلیل دارا بودن ویژگی هایی از جمله اثرات آنتی اکسیدانی، مهار آنزیم مونوآمین اکسیداز، به دام انداختن رادیکال آزاد، حذف یون های فلزی مضر، مهار حامل های دوپامین، اثرات ضد آپاپتوزی و حتی بهبود گردش خون مغز می توانند موجب افزایش بقای سلول های عصبی و تسریع ترمیم آسیب های مغزی شوند. امیدواریم با توجه به اطلاعات موجود و اثرات بیولوژیک گیاهان چینی و عصاره های گیاهی، روش های درمانی جدیدی برای بیماری پارکینسون کشف شود.

در نتیجه، برخلاف درمان های حاضر مانند جایگزینی دوپامین و یا عمل جراحی که بیشتر عوارض حرکتی بیماری را کاهش می دهند، گانودرما لوسیدوم با مهار فعال سازی میکروگلیا از تخریب سلول های عصبی جلوگیری کرده و یا موجب بهبود عملکرد در بیماری پارکینسون می شود. با توجه به دارو های موثر محدودی که وجود دارد، مطالعات بیشتری بر روی گانودرما لوسیدوم به عنوان یک داروی موثر در درمان پارکینسون نیاز است. پیش بینی می کنیم درمان های موثری در آینده نزدیک کشف خواهند شد.

 

منابع: ncbi

دیدگاهتان را بنویسید

Your email address will not be published.

top